家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子（hEGF），一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽，具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS—hEGF，将该重组质粒与线性化病毒Bm．BacPAK6DNA共转染家蚕细胞，筛选获得重组病毒vBacPAK—sEGR用vBacPAK—sEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕，Westernblot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23gg／100细胞，五龄幼虫中的表达量可达到82μg／mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb／c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性．结果表明表达产物能显著促进Balb／c3T3细胞的增值。另外，研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增加，睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。

重组里氏木霉膨胀素的生物学特性研究

微生物膨胀素在生物炼制行业具有重大潜在应用前途。开展了从重组里氏木霉膨胀素生物学特性测定的工作。研究了发酵液中膨胀素的生物活性,初步的生物活性测定显示,该蛋白单独使用不具水解纤维素活性,但在纤维素酶水解纤维素时表现出明显的协同活性。结果表明,温度和pH等因素对分离得到的swollenin蛋白活性影响较大,并确定了最适的pH和温度范围。

人工培育家蚕蛹虫草海宁株的药理学研究

对人工培育的家蚕蛹虫草菌进行了毒性和药理实验.结果表明,家蚕蛹虫草未显示毒性,并且具有同冬虫夏草相似的功效,如延缓衰老、镇静、消炎、抗缺氧和抗肿瘤等作用.

家蚕孤雌生殖差异蛋白——热休克相关蛋白的生物信息学分析

应用双向凝胶电泳(2-DE)技术研究家蚕孤雌生殖蚁蚕和正常蚁蚕的总蛋白质的差异,得到与孤雌生殖相关的差异蛋白点,并对这些蛋白点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析,获得了相关差异蛋白的序列特征。将这些序列与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,得到3个差异蛋白为热休克相关蛋白。通过5-′RACE的方法克隆到3个差异蛋白的全基因序列,并对它们进行结构和特征分析,有助于进一步研究其与孤雌生殖的关系。

Kazal型蛋白酶抑制剂结构与功能研究进展

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内,在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用,特别是对蛋白酶活性进行精确调控。其中Kazal型蛋白酶抑制剂是最重要的、研究最为广泛的酶抑制剂之一,该类抑制剂一般由一个或几个结构域组成,每一个结构域具有保守的序列和分子构象,同时发现该类抑制剂与蛋白酶作用的结合部位高度易变,它们大多数暴露于与溶剂接触的环上,其中P1部位是抑制作用的关键部位,抑制剂的专一性由P1部位氨基酸残基的性质决定,其它残基取代结合部位残基对抑制剂-酶的结合常数有显著的影响。Laskowski算法可直接从Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列推测其与6种丝氨酸蛋白酶之间的抑制常数(Ki)。目前在生物体内发现大量的Kazal型蛋白酶抑制剂,并证实其有重要的生物学功能。

家蚕孤雌生殖差异脂蛋白30K lipoprotein precursor基因的克隆与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳（2-DE）技术分离家蚕孤雌生殖蚁蚕总蛋白，并和正常蚁蚕总蛋白进行比较，得到46个可能与家蚕孤雌生殖相关的差异蛋白点。对这些差异蛋白点进行胶内酶解后基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOFMS）分析，经数据库搜索鉴定，确定其中一个差异蛋白点为脂蛋白30Klipoprotein precursor（30KLPP）。通过5′-RACE技术克隆到30KLPP脂蛋白的全长cDNA序列。生物信息学分析显示该差异蛋白基因全长917bp。编码261个氨基酸，理论分子质量为30．013kD，等电点为7．193；结构域和三级结构预测显示该蛋白包含1个Lipoprotein_11结构域和12个β-折叠。预测其信号肽概率为1．000，定位在1～20aa区域，即可能存在信号肽。细胞定位预测显示该蛋白可能分泌到胞外（SP值为0．934）。分析结果有助于进一步研究30KLPP脂蛋白结构与功能的关系。

14-3-3蛋白家族及其临床应用研究进展

14-3-3蛋白家族是一组高度保守的可溶性酸性蛋白质,分子量在28～33kD之间,广泛分布于各种真核生物之中。该蛋白能够特异地结合含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的肽段,参与多种信号转导途径。14-3-3蛋白调节着许多重要细胞生命活动,如:新陈代谢、细胞周期、细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录,该蛋白家族异常与疾病的发生密切相关,尤其是14-3-3蛋白在脑脊液中的分布与一些神经系统疾病密切相关。14-3-3蛋白已成为一些疾病的临床诊断指标,其作为疾病治疗的靶点也在研究之中。主要阐述了14-3-3蛋白的结构、功能、及其在疾病治疗中的应用。

EIAV减毒疫苗克隆株诱导体液免疫反应的时相研究

为研究马传染性贫血病毒病(EIAV)减毒疫苗免疫动物后体液免疫反应的成熟时相,选用健康马4匹,2匹接种EIAV感染性克隆减毒疫苗pLGFD3毒后,另2匹接种生理盐水做对照,接种后定期采集血样,采用ELISA方法检测各个时相点血清中gp90,p26的结合抗体滴度,并采用细胞蚀斑染色检测病毒中和抗体滴度,分析抗体反应的规律。结果显示,感染性克隆pLGFD3毒免疫后,针对envgp90和gagp26蛋白均产生了特异性的体液免疫反应,gp90结合抗体在2个半月左右达峰值,随后尽管有轻微的波动,一直维持在较高的水平直至免疫后5～6个月,随后开始轻微回落,在免疫后32个月时仍能检测到抗体的稳定存在,而p26结合抗体在1～2个月左右达峰值后则呈明显回落,在4个月时降至检测水平以下。gp90诱导的特异性中和抗体的水平同样在2个月左右达峰值,在整个观测期内持续稳定存在。结果表明,EIAV感染性克隆减毒疫苗免疫后,能诱导产生特异性的gp90,p26结合抗体以及中和抗体,而且gp90特异性抗体和中和抗体可持续稳定存在,这些抗体可能参与减毒疫苗诱导的免疫保护作用。

EF手图像超家族成员——肌钙蛋白C的研究进展

EF手图像超家族蛋白泛指一类含有由螺旋区-泡区-螺旋区构成的EF手图像模体的蛋白。这类蛋白通常都具有金属离子结合能力或者形成二聚体的能力。肌钙蛋白C是一种EF手图像蛋白,它具有钙离子结合能力,可以与肌钙蛋白I、肌钙蛋白T形成复合物调节肌肉收缩。目前,国内外对肌钙蛋白C的研究多数集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的研究较少。主要从EF手图像超家族的特性及其家族成员——肌钙蛋白C的分类、结构及功能等方面进行了阐述,并结合笔者自身的研究方向,简要介绍了家蚕肌钙蛋白C的研究情况及前景。

蜘蛛丝的结构性能及表达策略研究进展

蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维,具有高强度、高弹性、高断裂能等机械性能以及显著的可降解性、组织相容性等生物学特性,在生物医学、材料、纺织和军事装备等领域均有重大潜在应用价值。利用原核或真核表达系统表达蜘蛛丝蛋白可以大量获取蜘蛛丝。综述了蜘蛛丝蛋白序列结构特征以及蜘蛛丝蛋白在大肠杆菌、酵母、植物、动物细胞、家蚕等表达系统中的表达策略研究进展,并重点阐述应用家蚕表达系统表达蜘蛛丝蛋白的策略,可供规模化生产蜘蛛丝蛋白参考。

白介素-3研究进展

白细胞介素-3是白细胞介素家族重要成员之一,在机体的造血调节和免疫调节中起非常重要的作用。它的主要功能是能够迅速促进多能干细胞和各系祖细胞(与其他细胞因子协同作用)如CFU-GM、CFU-G、CFU-M、CFU-Meg、CFU-Ba的定向分化和成熟。IL-3与其他细胞因子的联合应用可增加化疗后肿瘤病人的中性粒细胞和血小板。

内皮抑素研究进展

内皮抑素是一种能够强烈抑制血管形成的抑制因子 ,能够有效地抑制肿瘤细胞的生长和转移 ,因此成为肿瘤研究领域的研究热点。就内皮抑素的发现 ,性质和结构 ,生物学功能 ,抑制作用机理 ,内皮抑素基因治疗以及目前在临床上的应用进行了简要总结和概括。

家蚕孤雌生殖相关蛋白PGL的鉴定与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳(2DE)技术分离有性生殖蚕卵与孤雌生殖蚕卵的差异蛋白,通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOFMS)分析获得大量小肽的序列特征。与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,确定一个在家蚕孤雌生殖过程中表达量显著上调的差异蛋白为磷脂酰肌醇蛋白聚糖(phosphatidylinositol glycan,PGL)。为了探讨PGL蛋白在家蚕孤雌生殖发生中的作用,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增目的基因5′端片段,获得PGL蛋白基因的全长cDNA,生物信息学分析显示该基因cDNA全长1038bp,编码345个氨基酸,其编码蛋白理论分子质量为39.516kD,等电点为5.845,包含1个保守的GPI8结构域,信号肽概率为0.997,可能为分泌型蛋白,预测蛋白功能域包含酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、N糖基化、蛋白激酶C磷酸化等多个功能位点。依据PGL蛋白的理化性质、结构功能推测其有可能在不同程度上通过细胞信号转导途径参与了家蚕孤雌生殖发生过程并发挥重要作用。

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。

重组死亡素裂殖酵母工程菌发酵的研究

在裂殖酵母基本培养基的基础上,通过正交设计.优化了培养基6个组分;优化后的培养基,摇瓶发酵,目的蛋白产量在26-51 mg/L之间,发酵罐的批次发酵,产量在51-102 mg/L之间。

家蚕Gar1p基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕功能基因筛选中获得一条长844 bp的基因序列,其编码蛋白与一种富含甘氨酸和精氨酸的核仁小分子RNA结合蛋白(glycine and arginine-rich nucleolar protein,Gar1p)的同源性达63%。利用生物信息学方法分析了该基因上游的启动子序列,发现该基因不含内含子,由1个699 bp的单一外显子编码232个残基的蛋白,预测分子量为22.4 kD,等电点11.43。该Gar1p蛋白的疏水性最大值为1.167,最小值为-2.011,其序列的两端各有1个强亲水性的GAR区域,而中间含有5个潜在的磷酸化位点。Gar1p基因已从家蚕基因组中扩增得到,并克隆进表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中得以表达,为研究其功能提供了条件。

家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及结合肽的研究

从家蚕核型多角体病毒镇江株 (BombyxmorinuclearpolyhedrosisvirusZhenjiangstrain ,BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆遍在蛋白 (BmVUB)基因 .序列分析结果显示 ,BmVUB基因长 2 34bp ,编码 77个氨基酸 .BmVUB氨基酸序列内有一致HTH序列 ,遍在蛋白保守序列LRLRGG ,参与遍在蛋白 蛋白酶复合体形成的 4个保守性功能位点 (Lys 2 9、Cys 4 8、Cys 6 3、Gly 76 )及保守的Gly Gly X (X是疏水氨基酸残基 )蛋白酶切信号序列 ,在遍在蛋白保守的Gly Gly后多出由一个氨基酸组成的延伸肽 .原核诱导表达表明BmVUB主要以可溶性形式存在 ,表达量占总菌蛋白的 5 0 %以上 .纯化的遍在蛋白浓度为 1 0 3～ 2 4 6 g/L ,制备抗体 ,效价在 3 2× 10 -5以上 .用噬菌体表面展示技术筛选遍在蛋白结合肽 ,所筛选的结合肽可与遍在蛋白特异性结合 ,其中结合肽VAPHHAYAPMRT对细胞增殖有明显的浓度调控作用 ,即低浓度促进细胞生长 ,高浓度强烈抑制细胞的生长 .

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27中腺苷酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

目的克隆Thermus thermophilus HB27隆腺苷酸激酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并获得了比较高的表达量并对其酶学性质进行分析。方法利用PCR技术从Thermus thermophilus HB27基因组中扩增得到腺苷酸激酶的基因片段,将其克隆到pET-28a表达载体上,以PCR\酶切和测序进行鉴定。利用光谱分析测定该重组酶的相关酶学性质。结果成功克隆和高效表达了腺苷酸激酶;重组酶的最适pH是8.5,最适温度是90℃。重组酶对底物ADP的米氏常数Km是68.6μmol/L,VmaxADP为0.294mmol/(L-1·min-1)。将该重组酶在70、80、90、100℃下分别作用7h后,发现仍具有酶活性,显示出高的温度耐受性。腺苷酸激酶的特异性抑制剂AP5A浓度为2.0mmol/L能够抑制重组腺苷酸激酶70%的酶活性,AP5A对重组腺苷酸激酶的抑制类型为竞争性抑制,其抑制常数为46.39μmol/L。结论成功克隆、表达重组腺苷酸激酶,为腺苷酸激酶的进一步应用奠定了基础。

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域(P-D2),并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。