A组轮状病毒结构蛋白VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

A组轮状病毒(rotavirus,RV)是婴幼儿严重病毒性腹泻的主要病原,VP6为轮状病毒的主要结构蛋白之一,天然VP6具有很强的抗原性和免疫原性。通过基因重组技术将A组轮状病毒T114中国地方株VP6基因克隆入转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒pBacPAK8-VP6与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6DNA共转染BmN细胞,获得重组病毒BmNPV-VP6。用BmNPV-VP6感染BmN细胞和家蚕5龄幼虫,Western blotting检测表明在BmN细胞和家蚕5龄幼虫的血淋巴中均可检测到120 kD的特异性条带,提示重组VP6蛋白在家蚕中获得表达,与VP6三体形式的大小相符合。ELISA检测结果显示,重组VP6蛋白在BmN细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中的表达分别在感染后第4天和第6天达到最高水平。VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达可为新型轮状病毒疫苗的研制提供新的途径。

应用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕培养细胞和幼虫体内表达β-淀粉样蛋白

作为阿尔茨海默症(AD)重要神经病理学特征之一的脑内老年斑主要由β-淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42聚集而成,Aβ42是其中的毒性成分。Aβ的特异性主动免疫对不同的转基因AD模型小鼠均有治疗作用,但临床试验中以注射方式给药容易诱发炎症反应。为了能够更好、更安全地采用主动的Aβ免疫疗法达到预防和治疗AD的目的,尝试用家蚕杆状病毒表达系统表达Aβ42蛋白。将Aβ42基因克隆入转移载体质粒pB acP AK8中,并使该重组质粒和家蚕杆状病毒Bm-BacP AK6线性化的DNA共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,经筛选、纯化获得的重组病毒命名为BmN PV-Aβ42。用BmN PV-Aβ42感染BmN细胞和家蚕5龄起蚕后,利用Western blotting在BmN细胞和5龄幼虫血淋巴中均可检测到5 kD左右的特异性条带,证明重组Aβ42蛋白表达成功。ELISA检测显示,重组Aβ42肽在感染后第4天的BmN细胞和感染后第6天的5龄幼虫血淋巴中的表达量分别达到1.1 pg/个、2μg/mL。进一步提高Aβ42在家蚕杆状病毒表达系统中的表达效率,有望为研发预防和治疗阿尔茨海默症的可食性疫苗提供新型原料。

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。

轮状病毒结构蛋白VP4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。

CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件优化及鉴定

目的探索融合基因CTB-Aβ42在大肠杆菌中表达的最适条件,并纯化得融合蛋白。方法设置不同的诱导温度、诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度,在大肠杆菌中表达融合基因CTB-Aβ42,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物,GST亲和色谱柱纯化目的蛋白,Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,GST-CTB-Aβ42融合蛋白分子质量约为45 kD,与预期结果一致;Western blot结果表明,纯化得到的目的蛋白具有免疫原性。在诱导条件为30℃,0.1 mmol/L IPTG诱导2 h表达的可溶性蛋白所占比例最高;在37℃,0.1mmol/L IPTG诱导4 h表达的融合蛋白总量最高,小部分可溶性表达,大部分以包涵体的形式存在。结论本实验对CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件进行了优化,经GST亲和色谱柱纯化获得具有免疫原性的融合蛋白。