分子伴侣CsaA过表达及wprA蛋白酶的缺失对枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白的影响

在枯草芽孢杆菌B.subtilis168菌株,以及在其改造菌株B.subtilis168wprA-和B.subtilis168/wprA::csaA中表达来自碱性芽孢杆菌C-125的碱性果胶酶和来自巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶。碱性果胶酶在B.subtilis中分泌表达时,敲除了wprA蛋白酶基因的B.subtilis168wprA-菌株相对于其野生型菌株B.subtilis168分泌表达的总的酶活力下降了36%,再次整合csaA进wprA位点后的B.subtilis168/wprA::csaA菌株,其表达量又恢复到相当于野生型菌株的表达水平。青霉素酰化酶在B.subtilis168wprA-菌株中的表达与野生型相比没有明显差异;而整合csaA分子伴侣进wprA位点后的菌株(B.subtilis168/wprA::csaA),相对于野生型其总的酶活力高出66%,说明分子伴侣CsaA数量的增加可以明显提高酶的表达量,并显示出普遍提高蛋白总活力的作用,而蛋白酶wprA基因的敲除,对某些蛋白的表达量能够产生明显的影响,在提高表达的稳定性方面表现出普遍的促进作用。本实验表达的青霉素酰化酶酶活力(14.7 U/mL)比工业应用中的酶活力(10 U/mL)高出了47%。

青霉素酰化酶(PGA)在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达

将巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶(PGA)基因整合进枯草芽孢杆菌的基因组,筛选获得可以使PGA稳定表达的枯草芽孢杆菌菌株,克服了枯草芽孢杆菌中质粒表达不稳定的缺点。分别构建了含不同PGA基因拷贝数的3种枯草芽孢杆菌菌株,同时分析了这些菌株中PGA表达量的差异。37℃试管培养36 h菌株B.subtilis/xhoI-,aprE-,vpr--的酶活力为3 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga为6 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga为14 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga,vpr::pga为23 U/L。结果表明,整合的拷贝数越多,PGA的表达量越高。

SARS冠状病毒3CL蛋白酶多克隆抗体的制备及纯化

SARS病毒(SARS-CoV)3CL蛋白酶在病毒的复制过程中起到关键作用,是抗病毒药物设计的重要靶标。本工作用在大肠杆菌中表达并纯化的SARS-CoV 3CL蛋白酶免疫新西兰大耳兔,获得了多克隆抗体血清;利用抗原偶联柱对血清进行了亲和纯化。SDS-PAGE以及Western-Blot结果显示纯化后的抗体纯度较高,特异性较强,为免疫学方法检测SARS-CoV 3CL在宿主细胞内的活动打下了基础。