茅莓总皂苷和高三尖杉酯碱、阿糖胞苷体外协同诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的:探讨茅莓总皂苷(TSRP)抑制K562和人原代白血病细胞及分别与化疗药高三尖杉酯碱(Hom)、阿糖胞苷(Ara-c)的协同作用,并探讨其协同作用的可能机制。方法:MTT法和PHA-LCM液相-半固体二步培养法检测不同浓度的TSRP对K562和人原代白血病细胞增殖及其与化疗药联用后的影响;观察TSRP分别和Hom、Ara-c联用的抑制作用,用药物相互作用指数评价药物协同作用;DAPI染色法观察一定浓度下TSRP协同化疗药诱导K562细胞凋亡;Western blot检测促凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Cleaved PARP以及抗凋亡蛋白Survivin的表达。结果:TSRP能够抑制K562和人原代白血病细胞的增殖,呈浓度依赖性,在一定浓度范围内TSRP和化疗药有显著的协同作用;DAPI染色法观察TSRP和化疗药协同较单用化疗药出现明显凋亡现象,诱导细胞发生凋亡;Western blot检测TSRP联合Hom较单用Hom显著提高了K562细胞内PARP、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活性;TSRP联合Ara-c较单用Ara-c显著提高了K562细胞内PARP和Cleaved caspase-3的活性,但是对Cleaved caspase-9的活性影响差别不大;TSRP联合Hom或Arac对Survivin的活性影响均未见明显差别。结论:TSRP分别和化疗药Hom或Ara-c联用对K562和人原代白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,且主要是通过线粒体途径增强凋亡效应,从而增加化疗药物的敏感性,具有良好的临床应用前景。

人参三醇对K562白血病细胞的抑制及增加化疗药敏感性的研究

目的 :探讨人参三醇 (GPT)对 K5 62白血病细胞生长的影响 ,及对化疗药敏感性的协同作用。方法 :在液体培养、半固体集落形成培养中 ,以不同浓度的 GPT处理 K5 62细胞 2 4、48、72小时 ,用细胞生长曲线和集落形成率来观察 GPT的增殖和抑制效应 ;用 MTT法检测 GPT对化疗药物的协同性。结果 :低浓度 (1 0μg/ml、2 0μg/ml)的 GPT能显著地刺激 K5 62细胞增殖 ,中浓度(5 0μg/ml)时使细胞增殖受抑 ,并呈时间—效应依赖性。 GPT分别与化疗药物高三尖杉酯硷(HHr)、阿糖胞苷 (Ara-c)联合应用能增加对 K5 62细胞的杀伤作用 ,抑制率为 (88.4± 2 .7) %和(73 .8± 8.8) % ,明显高于对照组的 (4 9.3± 9.3 ) %和 (3 0 .1± 7.5 ) % (P<0 .0 1 )。对低敏的足叶乙甙 (Vp-1 6)组也能使抑制率从原先的 <1 0 %提高到 >5 0 %。结论 :不同剂量的 GPT对 K5 62细胞具有刺激增殖和抑制生长的双相效应 ,并能增强 K5 62细胞对化疗药物的敏感性 ,是人参皂甙内抑制白血病细胞的有效成分 ,可为临床应用提供依据。

人参皂甙对白血病耐药细胞化疗药物敏感性的研究

目的 :通过观察人参皂甙 ( GS)协同化疗药物对 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr白血病耐药细胞株的抑制作用 ,探讨 GS是否能提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性。方法 :选用 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr两耐药细胞株作为靶细胞 ,液体培养和半固体集落培养法观察不同浓度的 GS对耐药细胞增殖的影响 ,及 GS协同化疗药物对 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr耐药细胞集落生成的抑制作用。结果 :1单用 GS作液体培养 MTT分析法和集落培养法均显示低、中等浓度的 GS5～ 5 0 μg/ml对细胞增殖无明显影响 ,但当浓度升高至 75 μg/ml时 ,则抑制细胞增殖和集落形成 ( P<0 .0 1 )。2当 GS与化疗药物联合应用时 ,即使化疗药物浓度 ( 1 μg/ml)不变 ,K5 62 /VCR、K5 62 /Adr耐药细胞对化疗药物的敏感性与 GS呈剂量依赖关系。即 GS浓度达到 5 0μg/ml时 ,化疗药物对细胞的抑制作用明显 ( P<0 .0 1 ) ,且随着 GS浓度的升高 ,抑制作用逐渐增强。结论 :GS通过提高耐药细胞对化疗药物的敏感性而与化疗药物起协同作用 ,同时在一定浓度下 。

萝卜硫素增加HL-60和人原代白血病细胞对化疗药敏感性实验研究

目的:探讨萝卜硫素(SF)对白血病细胞化疗药物敏感性的作用。方法:琼脂半固体集落培养法和MTT法检测不同浓度的萝卜硫素对HL-60细胞增殖的影响及协同化疗药对细胞生长的抑制作用;PHA-LCM液相-半固体二步培养SF协同化疗药抑制人原代白血病细胞生长。结果:琼脂半固体集落培养法和MTT法证实在一定浓度范围内SF对HL-60细胞增殖抑制(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性,SF能够增强HL-60细胞对化疗药物高三尖杉酯碱(Hom)和阿糖胞苷(Ara-c)敏感性(P<0.05);PHA-LCM液相-半固体二步培养法证实SF在一定浓度范围内对人原代白血病细胞有抑制作用(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性,并增加人原代白血病细胞对化疗药Hom和Ara-c敏感性。结论:萝卜硫素在一定浓度下有效抑制白血病细胞增殖,并能增强化疗药物的敏感性。

萝卜硫素诱导白血病细胞K562凋亡及其与化疗药协同作用的实验研究

目的:探讨萝卜硫素诱导K562白血病细胞作用及其与化疗药的协同作用。方法:琼脂半固体集落培养法和MTT法检测不同浓度的萝卜硫素对K562细胞增殖的影响;倒置显微镜观察萝卜硫素对细胞形态的影响,Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡调控蛋白PARP的活性;观察萝卜硫素分别和高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合的抑瘤作用,用药物相互作用指数评价药物协同作用。结果:萝卜硫素能够抑制白血病K562的增殖,呈剂量依赖性;萝卜硫素引起了K562细胞形态的明显改变,显著提高了细胞的早期凋亡率,增加了促凋亡蛋白PARP的表达水平;萝卜硫素与化疗药物高三尖杉酯碱和阿糖胞苷存在明显的协同作用,其协同系数分别为0.64和0.66。结论:萝卜硫素可以诱导K562细胞发生凋亡,增加化疗药物的敏感性,具有良好的临床应用前景。

罗秀素应用中医药治疗急性白血病临床经验

急性白血病是造血系统的恶性疾病,白血病占我国各年龄组恶性肿瘤的发病率和死亡率第6位（男性）和第8位（女性）,在儿童和35岁组的发病率和死亡率中占第一位[1]。一般认为该病的发生与环境污染、电离辐射、化学制剂、装潢后入住、频繁染发、药物、病毒和遗传因素等有关[2]。目前急性白血病的治疗主要采用传统的大剂量联合化疗,但化疗的毒副作用大,复发率高,且严重损害患者的造血与免疫系统[3]。骨髓移植虽然能使白血病达到完全治愈,

Th17细胞在特发性血小板减少性紫癜发病中的作用和意义

目的:本研究探讨Th17细胞在特发性血小板减少性紫癜(ITP)发病中的作用和意义。方法:采用FCM检测ITP患者组和正常对照组外周血中Th17细胞的比例;ELISA技术检测上述两组血浆中IL-17、IL-23、IL-6和TGF-β1的表达水平;RT-PCR技术检测外周血单个核细胞(PBMNC)中IL-17和RORγt mRNA的表达水平;Westernblot法检测PBMNC中pSTAT3和RORγt蛋白的表达水平。结果:ITP患者外周血Th17细胞比例较正常对照组显著升高,血浆中IL-17、IL-23、IL-6和TGF-β1水平明显高于正常对照组(P<0.01);ITP患者PBMNC中IL-17和RORγt mRNA表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);p STAT3和RORγt蛋白的表达水平明显高于正常对照组(P<0.05))。结论:在ITP发生和发展中,Thl7细胞亚群比例增高可能是一个重要的决定因素,Th17细胞相关的细胞因子及转录调控因子水平的变化与ITP发病密切相关。

白花蛇舌草注射液抑制HL-60细胞增殖及作用机理研究

本研究通过对白花蛇舌草注射液(hedyotic diffusa willdInjection,HDI)在体外抑制人白血病细胞株(HL-60)增殖作用的观察,以探讨HDI用于治疗白血病患者的作用机制。以白血病HL-60细胞株为靶细胞,采用MTT法观察不同浓度的HDI对HL-60细胞增殖的影响;用流式细胞术和DNA Ladder观察细胞凋亡、以及粒系细胞分化的表面标志(CD33、CD15)表达;RT-PCR检测HDI对survivin、bcl-2基因表达的影响。结果表明:低浓度的HDI(1.56ml/L)对HL-60细胞增殖无明显抑制作用(p>0.05),但当HDI浓度提高至3.12-12.5ml/L时,细胞则出现明显的增殖抑制,且随浓度增加抑制作用增强(p<0.05或p<0.01)。Annexin-V/PI双参数和DNA Ladder检测发现,HL-60细胞经不同浓度HDI诱导24、48、72小时后均未出现典型的凋亡现象,而粒系细胞表面标志CD15的表达,经不同浓度HDI诱导1周后均显著增高,CD33表达无显著变化。HL-60经HDI(6.25ml/L)处理2周后,survivin、bcl-2基因表达无明显变化;当处理3周后,survivin、bcl-2基因表达均明显低于未经处理过的细胞,分别低于60%和44%。结论:白花蛇舌草注射液在一定浓度下能够直接抑制白血病细胞增殖,其作用机制可能是通过诱导细胞分化、凋亡。

人参二醇、三醇皂苷对人骨髓造血祖细胞增殖作用的研究

目的:探讨人参二醇皂苷(panaxadiol saponin,PDS)和三醇皂苷(panaxtrol saponin,PTS)对骨髓造血祖细胞增殖的作用。方法:从人参总皂苷进一步分离纯化出PDS和PTS,用体外造血祖细胞集落形成技术,观察PDS、PTS对小鼠骨髓红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和多向祖细胞(CFU-Mix)的刺激增殖作用。结果:不同浓度的PDS(2.5～200μg/ml)可促进造血祖细胞增殖;CFU-E,BFU-E,CFU-GM和CFU-Mix集落产率均显著高于对照组(P<0.05),提高率(％)分别达54.9±6.3、48.8±5.1、27.6±4.2和48.9±3.9。而PTS在同样浓度时,CFU-E、BFU-E产率均显著低于对照组(P<0.05);终浓度为200μg/ml时,CFU-E、BFU-E集落产率为零。在CFU-GM培养中,12.5μg/ml浓度的PTS使集落产率提高(29.7±2.2)％(P<0.05);而100μg/ml和200μg/ml的PTS却出现对CFU-GM的抑制作用,抑制率分别为(48.6±3.9)％和100％。结论:PDS是总皂苷内促进造血的有效成分,而PTS对红系祖细胞具有抑制作用,对粒-单系祖细胞的作用呈剂量依赖关系。

葛根素注射液对K562/Adr细胞化疗药物敏感性及机理研究

目的：通过观察葛根素注射液协同化疗药物对K562／Adr白血病耐药细胞的抑制作用，探讨葛根素增加白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性及作用机理。方法：选K562／Adr耐药细胞株作为靶细胞，采用MTT法观察不同浓度的葛根素注射液对K562／Adr耐药细胞增殖的影响，及细胞对化疗药物的敏感性。RT—PCR的方法检测葛根素对耐药相关基因（MDR1／P-gp、MRP）表达的影响。结果：①MTT法结果显示低到中等浓度的葛根素（25～100μg／mL）对15562／Adr耐药株的生长与对照组相比无显著差异（P〉0.05），但当葛根素浓度提高至250μg／mL以上时，对细胞则出现增殖抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强。②用不同浓度的葛根素和化疗药物（Adr 1μg/mL）合用时结果显示，低浓度（25～50μg／mL）的实验组与对照组无显著差异（P〉0．05）；随着葛根素浓度增加（100～500μg／mL），Adr对细胞的抑制作用明显，即K562／Adr对Adr的敏感性与葛根素呈剂量依赖吴系。③K562／Adr细胞经葛根素（100μg/mL）处理1周后，MDR1基因表达受到抑制，是未经处理细胞的2．5倍，MRP基因表达在处理前后无明显变化；当处理1个月后，细胞中MDR1、MRP两基因表达均明显低于未经处理过的细胞，分别是未经处理细胞的2．6倍和3．5倍。结论：葛根素注射液在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖，并能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性；其机制可能通过对耐药相关基因（MDR1、MRP）表达抑制来起作用。

人参皂甙诱导HL-60细胞凋亡的研究

目的 :观察人参皂甙 (GS)是否具有诱导髓性白血病HL 6 0细胞株的凋亡作用。方法 :取不同浓度的GS处理HL 6 0细胞 ,观察GS所致的细胞形态学的变化 ;流式细胞术分析细胞DNA含量的改变 ,并进行DNA片段分析 (DNALadder) ;用AnnexinV FITC试验法分析细胞凋亡百分率。结果 :人参皂甙能够抑制HL 6 0细胞生长 ,在一定剂量和时间范围内可引起细胞凋亡。结论 :提示人参皂甙能特异性地诱导HL 6 0细胞凋亡 。

白花蛇舌草注射液抑制白血病细胞增殖及对线粒体跨膜电位的影响

目的：通过对白花蛇舌草注射液（HDI）在体外抑制人白血病细胞株（HL-60、K562）增殖作用的观察,来探讨HDI用于治疗白血病患者的作用机制。方法：以白血病HL-60、K562细胞株为靶细胞,采用MTT法观察不同浓度的HDI对HL-60、K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测两细胞在药物处理前后细胞内线粒体跨膜电位（ΔΨm）的水平;用激光共聚焦显微镜观察药物处理前后细胞内线粒体的荧光探针5,5’,6,6’四氯1,1’,3,3’四乙基苯并咪唑基羰化青碘（JC-1）在细胞内的荧光颜色变化。结果：低浓度的HDI（1.56mL/L）对HL-60、K562细胞增殖均无明显抑制作用（P〉0.05）,但当HDI浓度提高至3.12-25mL/L时,对HL-60细胞则出现明显的增殖抑制作用,且随浓度增加抑制作用增强（P〈0.05或P〈0.01）;而明显抑制K562细胞增殖,则浓度提高至6.25mL/L,且随浓度增加抑制增强（P〈0.05或P〈0.01）。通过流式细胞术对JC-1检测发现HDI能降低HL-60、K562细胞内线粒体跨膜电位（ΔΨm）水平,且随浓度增加降低越明显;激光共聚焦显微镜观察发现经药物处理过的凋亡早期细胞内JC-1不能聚集在线粒体的基质中，为单体，细胞则发绿色荧光，而未经药物处理过的活细胞内JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物（J—aggregates），细胞则发桔黄色荧光，两细胞产生的荧光颜色变化也提示药物处理前后细胞内线粒体膜电位的变化。结论：白花蛇舌苹注射液在一定浓度下，能够直接抑制HL-60、K562白血病细胞增殖，其作用机制有可能通过降低线粒体跨膜电位，触发细胞凋亡过程，从而抑制细胞增殖。

miR-223对粒细胞性白血病细胞增殖影响及作用机理

通过在体外将miR-223 duplex转染至粒系白血病细胞株(HL-60、NB4),观察其对粒系白血病细胞增殖作用的影响,来探讨miR-223对白血病细胞诱导分化及作用机理。以白血病HL-60、NB4细胞株为靶细胞,采用MTT法和半固体集落法观察不同浓度的miR-223对HL-60、NB4细胞增殖的影响;流式细胞术观察粒系细胞分化的表面标志(CD11b+、CD15+)表达;RT-PCR检测miR-223对c/EBPα、NFI-A转录因子表达的影响以及用免疫印迹反应观察相应蛋白的表达情况。结果表明:(1)低浓度的miR-223(10nM、20nM)均抑制HL-60、NB4细胞增殖(P<0.05或P<0.01),但在HL-60细胞中随着其浓度的增加(50nM、100nM),抑制作用与对照组相比无差异;而NB4细胞中随浓度增加抑制作用却没有增强(P<0.05)。半固体集落培养结果显示与MTT结果相一致。(2)流式细胞术检测用不同浓度的miR-223转染粒系细胞中发现,粒系细胞表面标志CD11b+表达在低浓度(10nM、20nM)下随其浓度升高而增加,但浓度增至50nM、100nM时表达有所下降;而CD15+在HL-60细胞中表达无显著差异,NB4细胞中表达趋势与CD11b+一致。(3)两细胞在miR-223作用前后提取总RNA分别进行RT-PCR检测显示,NB4细胞中NFI-A转录因子表达随浓度增加而降低,分别低于未经处理的0.6倍、2.0倍、1.1倍和1.5倍。c/EBPα基因表达随浓度增加而增加,分别是未经处理细胞的1.5倍、2.0倍、1.8倍和2.0倍。而在HL-60细胞中c/EBPα基因表达无明显差异,NFI-A仅在20nM浓度下表达下降差异显著,低于未经处理细胞的3.0倍。对NB4细胞中的NFI-A蛋白免疫印迹分析发现,经miR-223处理过的细胞中NFI-A蛋白含量随浓度增加而有所下降。结论:转染一定浓度miR-223至粒系白血病细胞中,能够抑制恶性细胞克隆增殖,其作用机制有可能通过竞争性抑制NFI-A转录因子表达,恢复与分化相关的c/EBPα转录因子的表达,来诱导粒系白血病细胞向成熟方向分化。

黄芪多糖对拟缺血损伤内皮祖细胞保护作用的实验研究

目的通过动物实验，评价黄芪多糖对拟缺血内皮祖细胞的保护作用。方法采用凝血酶损伤内皮祖细胞复制大鼠部分缺血损伤模型，不同浓度黄芪多糖预干预内皮祖细胞24h、凝血酶损伤8h后，用四甲基偶氮唑盐染色法检测细胞活性，蛋白印迹法和聚合酶链反应检测内皮祖细胞在蛋白及基因水平表达的变化。结果凝血酶损伤后，与正常对照组相比，凝血酶损伤组细胞活性明显下降，Ang-1及其受体表达下降（P〈0.05）；与凝血酶损伤组比较，黄芪多糖各组细胞活性上升， Ang-1及其受体表达上调（P〈0.01）；黄芪多糖各剂量组间呈剂量依赖。结论凝血酶可诱导内皮祖细胞损伤，黄芪多糖可抑制凝血酶所致体外培养的EPCs的损伤，对内皮祖细胞有保护作用，其机制与增加Ang-1及其受体表达有关，为缺血性疾病提供了新的治疗思路。

麝香保心丸对血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的:观察麝香保心丸(SXBXW)对血管平滑肌细胞表型转化的影响。方法:以血管平滑肌细胞系RASMCP8为模型,设对照组,SXBXW0.25、0.5、1.0和2.0g/L组,经不同浓度的SXBXW作用后,用流式细胞术测定RASMCP8细胞的收缩型特异性分子标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)表达的变化。结果:与对照组相比,经SXBXW处理后,α-SMA和SM-MHC的阴性细胞百分比降低,阳性细胞百分比增加。结论:SXBXW能促使血管平滑肌细胞的表型从合成型向收缩型转化。

人参皂苷诱导人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的研究

目的通过观察人参皂苷(GS)诱导人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)凋亡,探讨GS影响T淋巴白血病细胞增生作用的机制。方法选用人T淋巴细胞株(Jurkat细胞)作靶细胞,采用MTT法和半固体集落培养法观察不同浓度的GS对Jurkat细胞增生的抑制效应;用An-nexinV-FITC试验法分析Jurkat细胞的凋亡百分率,并进行DNA片段分析(DNALadder)。结果MTT法和半固体集落培养法均显示GS在50μg/mL浓度下能够明显抑制Jurkat细胞增生,并随浓度增加抑制作用增强;流式细胞术显示GS在一定浓度和时间范围内可引起细胞凋亡。结论GS在一定浓度范围内可抑制Jurkat细胞增生,并能够诱导其凋亡,为临床应用提供理论依据。

麝香保心丸对内皮素-1诱导原代培养的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:观察麝香保心丸(SXBXW)对内皮素-1(ET-1)诱导原代培养的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法:建立ET-1刺激原代培养人脐动脉VSMCs增殖的细胞模型,设对照组、ET-1组、ET-1+SXBXW0.25g/L组、ET-1+SXBXW0.5g/L组、ET-1+SXBXW1.0g/L组和ET-1+SXBXW2.0g/L组,采用MTT法测定ET-1和SXBXW对细胞增殖的影响;用台盼蓝拒染和乳酸脱氢酶检测方法观察不同浓度的SXBXW对VSMCs的毒性作用;用流式细胞术观察ET-1和SXBXW对VSMCs增殖周期的影响。结果:与对照组相比,ET-1可显著促进VSMCs的增殖,一定剂量的SXBXW能够有效地抑制ET-1诱导的VSMCs细胞增殖,呈剂量依赖性;SXBXW抑制细胞增殖,但对活细胞数目和乳酸脱氢酶释放量均没有影响,提示对VSMCs无毒性作用。ET-1能够刺激VSMCs从G1期进入S期,从而促进细胞增殖,而SXBXW能抑制这一作用。结论:SXBXW能够有效抑制ET-1诱导的VSMCs增殖作用,其作用机制可能与其抑制细胞周期从G1期进入S期有关。

Aβ_(1-40)诱导皮层神经元凋亡和人参二醇的保护作用

目的:研究β-淀粉样肽(Aβ1-40)对原代培养的小鼠大脑皮层神经细胞凋亡的诱导和人参二醇(panoxadiol)的保护作用。方法:通过形态学观察,MTT法检测,DNA琼脂糖凝胶电泳,Western-blot等方法研究Aβ1-40对皮层神经元的损伤及人参二醇(由浙江省中医院提供)的保护作用。结果:原代培养的小鼠大脑神经细胞经12μmol/LAβ1-40作用48h后,Aβ1-40损伤组神经细胞出现明显的凋亡特征,OD值降低,DNA电泳出现DNA片段,凋亡细胞数目增多。Western-blot显示Aβ1-40损伤组bcl-2表达下降(P<0.05),而40mg/L人参二醇预处理24h后可明显改变上述凋亡特征。结论:40mg/L人参二醇可减缓12μmol/LAβ1-40诱导培养皮层神经元凋亡,对凋亡细胞有一定的保护作用。