贝莱斯芽孢杆菌TCS001悬浮剂配方优化及对草莓炭疽病的防治效果

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis TCS001是一种新型的海洋生防细菌,具有广谱抑菌活性和促进植物生长的作用,在农业实际应用中具备开发潜力。本研究采用含毒介质法、生长量测定法以及悬浮性能评价的方法,筛选了与TCS001相容性高的润湿分散剂、增稠剂、防腐剂等助剂及其配比,所得TCS001悬浮剂(TCS001 SC)最佳配方组成为:40%TCS001发酵液(≥10^(10)CFU/mL)、3%润湿分散剂SXC、3%润湿分散剂UNA、0.15%增稠剂黄原胶、0.2%防腐剂卡松、0.2%防腐剂苯甲酸钠,水补足至100%(均为质量分数)。其活菌数为4.0×10^(9)CFU/mL、杂菌率为4.8%、pH值为6.68、悬浮率为97.8%、75μm试验筛通过率为99.9%、倾倒后残余物质量分数为1.6%、洗涤后残余物质量分数为0.41%、持久起泡性(1 min后)为16 mL,各项性能均符合行业标准(NY/T 2989-2016)。TCS001 SC在不同温度下的储存稳定性测定结果显示:(0±0.2)℃储存7 d、(4±0.2)℃储存360 d活菌数均较储前无明显差异,(28±0.2)℃储存360 d、(35±0.2)℃储存84 d菌体存活率均在80%以上,表明该制剂储存稳定性较好。在此基础上,以草莓炭疽病为靶标,开展田间药效试验,结果发现,TCS001 SC1500~3000 mL/hm~2喷雾处理可以显著减轻草莓炭疽病的发生,防治效果在59.37%~79.52%之间。其中3000 mL/hm~2间隔7 d,连续喷雾3次对草莓炭疽病的防治效果达到79.52%,该结果可为TCS001 SC用于登记防治草莓炭疽病的微生物杀菌剂提供理论基础。

新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的双控表达质粒构建及表达条件优化

利用化感物质开发除草剂是目前新型除草剂发展的一个重要方向。高粱素是高粱中分泌的一种化感物质,可对多种杂草的生长表现出显著的抑制作用。高粱烷基间苯二酚合酶（alkylresorcinol synthase,SbARS）是高粱素生物合成的关键酶。当以大肠杆菌Escherichia coli作为宿主进行SbARS的胞内表达时,细胞破碎是其中最为费时且最昂贵的步骤之一。本研究通过构建新型双控表达质粒p BM123-ars,实现了SbARS在大肠杆菌BL21（DE3）中的温控自裂解异源表达;在此基础上,通过优化诱导表达条件,可获得最高的SbARS酶活力（相对酶活力为160.04%±8.12%）及最高的裂解率（82.81%±3.14%）。研究结果可为新型除草剂高粱素的生物合成奠定理论基础。

基于定向进化的烷基间苯二酚合酶改造

烷基间苯二酚合酶(ARS)属于研究蛋白结构与功能关系的模式分子——Ⅲ型聚酮合酶家族,其产物烷基间苯二酚是一种具有极其重要生物学功能活性的物质。为进一步提高ARS的酶活性,研究在成功实现ARS在大肠杆菌中进行温控自裂解异源表达的基础上,通过易错PCR及定点随机突变构建酶基因突变文库,并结合高通量筛选,获得酶活力显著提高的突变子ARSSd-3(A207S/M266A/T256S)。酶学性质研究发现:ARSSd-3的底物选择性向长链脂肪酰SNAC略有偏移;当以棕榈酰-SNAC为底物时,ARSSd-3的酶活力是ARS的1.55倍,米氏常数(Km)降低至(6.8±1.3)μmol/L,最大反应速率(Vmax)增加至(234.1±9.8)pmol/(min·nmol)。研究结果对探究ARS的催化机制及其生产应用具有一定意义。

井冈霉素发酵过程溶氧浓度的优化控制

针对5 000 L和50 000 L发酵罐研究空气流量对井冈霉素效价的影响。通过5 000 L发酵罐罐中的试验发现,在后期DO上升时,通过降低搅拌转速或通气量来使DO维持在一定水平,对井冈霉素的生产没有影响。为简化实际生产上的工艺控制,在50 000 L发酵罐上分阶段控制通气量,对效价影响幅度仅有-0.54%,试验证明发酵过程中可较大程度减少无菌空气的使用量。研究结果对生产成本的降低有重要指导意义。

生物催化在农药生产中的应用及发展潜力

农药在农业中具有独一无二的地位,尽管传统的化学合成方法在农药生产中占有极高的比例。化学方法也存在诸多问题,如操作复杂、成本高以及环境污染等。近年来,生物催化所表现出的高选择性、反应条件温和、低毒低污染等特点逐渐受到许多企业的青睐,其在农药生产中的应用比重也持续增加。综述了生物催化在手性农药的去消旋化、不对称合成等方面的研究以及应用情况。

多目标优化新型除草剂高粱素生物合成关键酶ARS的异源双控表达

[目的]基于试验设计对高粱素生物合成关键酶-烷基间苯二酚合酶(Sb_ARS)的异源双控表达进行多目标优化。[方法]在前期成功进行Sb_ARS的温控自裂解异源表达的基础上,依次通过PB设计、最陡爬坡设计、响应面设计及线性加权多目标优化等方法,分析了11个与Sb_ARS在大肠杆菌中双控异源表达密切相关因素的影响。[结果]菌体培养时长、IPTG诱导时长和甘氨酸浓度对Sb_ARS酶活力和裂解率影响显著;当菌体培养时长为6.8h、IPTG诱导时长为4.6 h和甘氨酸质量浓度为1.0 g/L时,可获得总体最优Sb_ARS酶活力(117.12±0.13)%和裂解率(89.21±0.35)%。[结论]研究结果为新型除草剂高粱素的生物合成研究奠定理论基础。