浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA(ribo-somal DNAr,DNA)的ITS(internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性。利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rD-NA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段。ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(>0.60)聚为一类,具有较近的亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性。

化学杀菌剂对植物病原菌和生防菌MT-06的选择毒性

研究了6种化学杀菌剂对7种植物病原菌和生防菌株MT-06的选择毒性,结果表明:代森锰锌对番茄早疫病菌、水稻立枯丝核菌及甜瓜蔓枯病菌三种病原菌的TSR值(益害生物毒性选择性比值)分别为4.5946、4.4536和2.2885,表明有正向选择性(TSR>1)。百菌清对水稻立枯丝核菌和甜瓜蔓枯病菌的TSR值分别为12.9743和18.2633,具有正向选择性。甲霜锰锌对番茄早疫病菌、茭白胡麻斑病菌、水稻立枯丝核菌及甜瓜蔓枯病菌的TSR值分别为13.9277、13.9277、2.89和2.4596,具有正向选择性。这三种化学杀菌剂可作为与生防菌株MT-06混配的备选药剂进行相应病害的防治试验。防治番茄早疫病盆栽试验结果表明:MT-06和化学杀菌剂混配与单独施用化学杀菌剂相比,在达到相近防治效果的情况下,可大幅降低化学药剂的使用量;适量的化学杀菌剂和MT-06混配与单独施用MT-06相比,对番茄早疫病的防治效果显著增强。

杂草和水稻梨孢菌亲缘关系研究

利用12个引物的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)对来自18种寄主的49个梨孢菌株进行了亲缘关系分析,从DNA电泳谱带中可以直观地看出,来自同一种或同一属或亲缘关系相近寄主上的梨孢菌带型较相似,相反,亲缘关系较远的寄主上的梨孢菌带型差异较大,茭白、碎米莎草和马唐寄主上的梨孢菌的谱带均非常特异,与牛筋草和狗尾草等其他15种寄主的梨孢菌有较大差异,牛筋草和狗尾草等15种寄主的梨孢菌存在比较多的共有谱带。对引物S380扩增的RAPD谱带进行聚类分析表明,18种寄主上的49个梨孢菌株可分为5个类群。种与种之间的DNA(RAPD谱带)电泳谱带差异非常明显,而种内品种间的带型差异比较小。

马唐生防菌Col-68发酵条件的筛选

为了最大程度增强马唐生防菌Col-68在发酵过程中产孢能力以及次生代谢产物除草活性,试验以Col-68发酵滤液对马唐种子根、芽生长的抑制率为活性指标,综合不同培养条件下菌株产孢的差异,利用单因素筛选试验筛选出了适合该菌株发酵的不同碳氮源、碳氮比及初始碳源适宜浓度。研究结果表明,在初始pH=6.5,每300 mL锥形瓶装液120 mL,接种100μL菌原液,28℃、160 r.min-1震荡培养10 d的最佳发酵条件下,菌株活性差异显著,以蔗糖为碳源时Col-68活性、产孢量以及对马唐根长抑制率最高,蔗糖浓度在30～50 g.L-1时菌株产孢量以及对马唐根长抑制率较高,发酵最适宜利用的氮源为硝酸钠,最佳碳氮比则为2.5∶1.0。同时,不同条件下的发酵滤液对马唐根生长的抑制率均明显高于对芽生长的抑制率。

高效液相色谱法测定水稻穗部的GA_3含量

以水稻穗部为材料,探索内源赤霉酸(Gibberellin A3,GA3)的提取和纯化方法,利用高效液相色谱法建立分析测定方法。针对水稻样品富含色素和多酚类等杂质的特点,用氯仿去除色素,然后采用三步萃取法纯化GA3。在以往用高效液相色谱法分析植物内源激素的研究基础上,试验对色谱条件进行了改进。研究发现,最优色谱条件包括紫外检测器在254 nm波长下进行检测,以乙腈—水—乙酸(体积比为20∶79∶1)溶液为流动相,流速为1.0 mL.min-1等条件下峰形良好且保留时间稳定。结果表明,按照本试验流程,样品的添标回收率在80%以上,且相对标准偏差小于3%,较高的回收率和精密度表明本试验流程可以准确地分析测定水稻穗部GA3。

真菌中一氧化氮生物合成、降解及功能的研究进展

一氧化氮是一个有较高活性的自由基气体分子,无论在动植物还是微生物中,作为一个细胞内和细胞间的信号传导分子,它在许多的生理和病理过程中都发挥着双向的调节作用。研究发现真菌细胞可以合成一氧化氮,适当浓度的一氧化氮在真菌细胞内发挥多种重要的生物学功能,一旦一氧化氮过量累积,这个自由基分子会对细胞造成伤害,导致细胞凋亡。一氧化氮介导生成的环鸟苷酸(cGMP)作为一种重要的第二信使分子涉及到真菌细胞内多种信号途径的调控,调节了整个真菌类群的生长发育、形态发生、孢子形成和萌发、繁殖和细胞凋亡的过程,影响了真菌整个生命周期的生理活动。到目前为止,尽管一氧化氮在动植物中作用的机制得到了广泛的研究,但一氧化氮在真菌中的研究报道很有限。关于一氧化氮在真菌中的合成和降解途径,一氧化氮介导的信号传导机制的研究还不透彻,它在真菌细胞内的功能和毒理还有待于更深入的研究。

立枯丝核菌不同融合群菌株GPD基因的克隆及序列特征分析

利用同源克隆的方法对11个立枯丝核菌标准融合群菌株的GPD基因进行了分离。分析发现不同融合群立枯丝核菌GPD基因在外显子数目、编码蛋白长度及内含子剪切方式等方面存在差异,如AG-2-2ⅢB、AG-2-2Ⅳ、AG-8三个融合群的GPD基因的外显子个数为10个,其他融合群均为11个;AG-8融合群的GPD基因的编码蛋白长度为267个氨基酸,其余融合群的GPD基因的编码蛋白长度约为340个氨基酸。AG-2-2ⅢB、AG-2-2Ⅳ、AG-8三个融合群的GPD基因在98、98、272氨基酸位点的内含子发生了缺失。基于蛋白序列的进化分析表明不同融合群之间GPD基因编码蛋白存在明显差异,可以有效地将不同融合群菌株区分开来;同时,不同物种之间GPD基因在进化上仍具有一定保守性,立枯丝核菌自身的GPD基因蛋白序列归为一类且与担子菌门同源性最高。这些结果表明进行保守基因序列差异分析是进行立枯丝核菌分类分群研究的新思路。

不同抗药性水平二化螟幼虫中肠细菌群落多样性分析

为探讨二化螟Chilo suppressalis(Walker)肠道微生物多样性与抗药性的关系,本研究采用基于16S rDNA的变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16S rDNA文库序列分析方法,检测和分析了二化螟4个抗药性水平不同的种群幼虫中肠细菌群落多样性。生测结果表明,以二化螟黑龙江种群(HIJ种群)作为相对敏感品系,连云港种群(LYG种群)对杀虫单、毒死蜱、三唑磷的抗性为低抗至中抗水平,瑞安种群(RA种群)和诸暨种群(ZJ种群)的抗性为中抗至极高抗水平,这3个种群对阿维菌素均为敏感水平。16S rDNA文库序列分析表明,PCR扩增得到的16S rDNA基因代表了二化螟幼虫中肠内21种细菌系统发育型,其中大多数属于链球菌属Streptococcus。在不同抗药性水平二化螟种群中,幼虫中肠微生物群落除ZJ种群的Lactococcus garvieae,L.lactissubsplactis和Ochrobactrum anthropic等3种菌较丰富外,其余均以肠球菌属Enterococcus为主。DGGE图谱显示,HIJ种群条带较为单一,LYG种群条带最为丰富,ZJ种群与RA种群条带丰富度相似。4个种群均出现Enterococcus faecium,E.hirae和Arthrobacter sp.等细菌,且以肠球菌属Enterococcus为主。结果显示了不同抗药性水平的二化螟种群中肠细菌群落的丰富度存在差异,推测可能与二化螟不同抗药性差异有关。

稻瘟菌拮抗细菌的筛选与鉴定

从不同水稻根际土壤样品中分离纯化了486株细菌。采用平板测定法和微培养离体测定试验获得12株对稻瘟菌有不同程度抑制作用的拮抗细菌。结果表明:B4,B8,B18,B31,B34,B73和B74等菌株对稻瘟菌菌丝生长抑制率均在80%以上,其培养液100%抑制稻瘟菌孢子萌发;同时对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌等多种病原真菌有较好抑制作用,经鉴定该组拮抗细菌为枯草芽孢杆菌。B1,B43和B44菌株对稻瘟菌菌丝生长和孢子萌发有较好抑制作用,对水稻纹枯病菌具有一定的抑制作用,经鉴定为短小芽孢杆菌。B48和B59为链霉菌,对稻瘟菌的抑菌带明显,但对稻瘟菌孢子萌发和附着胞的形成抑制作用不明显。

抗感吡虫啉褐飞虱种群抑制消减杂交cDNA文库的构建

采用抑制消减杂交(SSH)方法构建了对吡虫啉敏感和抗吡虫啉褐飞虱种群的正反向差减cDNA文库,克隆了受吡虫啉调控的相关基因。结果表明,筛选到的120个阳性克隆代表92个互不重复的单基因,其中17个与动物的已知蛋白基因存在较高的同源性。筛选到的单基因,分别涉及信号传导、生物及非生物胁迫、生殖等。

4种杀菌剂对茭白锈病的防治效果

通过4种杀菌剂对茭白锈病的防效和茭白安全性的评价,旨在筛选出替代三唑酮防治茭白锈病的药剂。结果表明,在供试的4种杀菌剂中,对茭白锈病防效最佳的是烯唑醇,其次为三唑酮,而苯醚甲环唑和代森锰锌防效相近;对茭白孕茭和产量影响最小的也是烯唑醇,其次是苯醚甲环唑,三唑酮和代森锰锌的影响大。可见烯唑醇是一种高效、且相对安全的杀菌剂,可替代三唑酮防治茭白锈病。

稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用

根据稻曲病菌核糖体转录间隔区(ITS)序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时PCR定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。

稻粒黑粉菌冬孢子萌发影响因素及其产孢培养基的筛选

稻粒黑粉病是由担子菌亚门齿黑粉菌属的稻粒黑粉菌引起的。试验设置不同的温度、湿度、光照时间、pH值等培养参数,观察这些不同的参数对稻粒黑粉菌冬孢子萌发的影响。结果表明,冬孢子在充分吸水、温度24～28℃、光照与黑暗间隔培养12 h、pH值为7左右的条件下,最适宜冬孢子萌发。试验还观察并描述了稻粒黑粉菌冬孢子的形态特征和萌发过程。此外,为了建立稻粒黑粉病人工接种体系及研究稻粒黑粉菌与水稻之间的互作,需要筛选到能够产生稻粒黑粉病的接种体——次生小孢子的培养基。试验还研究了麸皮培养基等7种液体培养基的产孢效果,结果发现麸皮培养基最适合稻粒黑粉菌产生次生小孢子.