蛋白质组学技术及其在工业微生物研究中的应用

随着后基因组时代的到来,蛋白质组学的研究受到越来越多的关注,双向凝胶电泳和生物质谱技术是蛋白质组学研究的两大工具。微生物被广泛应用于食品、化工、医药等领域,随着这些领域的快速发展,利用蛋白质组学技术解析微生物代谢途径及调控机制越来越受到重视,从而为进一步的菌种改良提供理论依据。主要综述了蛋白质组学相关技术及其在工业微生物代谢途径与调控机制研究中的应用进展。

有机相脂肪酶催化合成山梨酸乙酯的研究

山梨酸乙酯是一种低毒高效的食品防腐剂.对有机相中脂肪酶催化合成山梨酸乙酯进行研究,对酶催化条件进行了优化研究.实验结果表明:固定化南极假丝酵母B脂肪酶(Novozym 435)有较好的催化活性.在单因素实验的基础上,考察了反应溶剂、乙醇/山梨酸摩尔浓度之比和温度等因素对脂肪酶Novozym 435催化合成山梨酸乙酯反应的影响,确定了酶催化反应最优工艺条件,在叔丁醇反应体系中反应10h,山梨酸乙酯得率达到97.4%.

酰胺酶的挖掘及在有机合成中的应用进展

酰胺酶是一类作用于分子内酰胺键,催化酰胺水解生成相应的羧酸和氨的重要生物催化剂。酰胺酶的广底物谱,高度化学、区域和立体选择性等特性,使其在制备医药及农用化学品等方面占有重要地位。根据氨基酸序列的差异,酰胺酶可分为酰胺酶标签家族和腈水解酶家族两大类。本文结合笔者研究团队在酰胺酶生物催化领域的研究工作,综述了近年来酰胺酶结构解析和催化机制等方面的研究进展,并介绍了酰胺酶在医药、农用化学品合成中的应用。

D-阿洛酮糖及其合成研究进展

D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的己酮糖,可以预防糖尿病、维持正常血脂水平,避免传统甜味剂对人体造成的代谢负担,具有重要的应用价值,但在自然界中含量稀少,近年来涌现多种D-阿洛酮糖的合成方法。文章围绕D-阿洛酮糖的功能、化学合成法和生物酶异构化法等内容开展综述,重点阐述了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的来源及性质、结构及催化机制、分子改造、多酶偶联、食品级表达等方面的研究进展,旨在推进生物转化制备D-阿洛酮糖的工业发展,为保障公众营养健康提供新思路。

硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cysK的组成型启动子,在质粒pA*H上插入glpE和nrdH基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化硫模块,最后通过对培养基的优化提高了硫代硫酸盐的供给,从而提高L-甲硫氨酸产量。结果表明:使用构建得到的E.coli W3110 JAHFEBL trc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株,发酵48 h后L-甲硫氨酸摇瓶水平产量达到1.3 g/L,较对照组提升了41.5%;通过对培养基的进一步优化,L-甲硫氨酸产量最终达到2.3 g/L,相比未优化的发酵水平提高了77.0%,且该研究为其他含硫氨基酸的生物合成提供了基础。

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸的研究进展

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸是目前生物加工过程的研究热点之一。ω-转氨酶具有优良的立体选择性及区域选择性,利用其进行生物催化生产手性胺,已被应用于医药、农药和化工等领域。本文中,笔者综述了ω-转氨酶的基本结构特性,并以转氨酶法制备西他列汀关键中间体等为例,同时阐述了该酶的高通量筛选方法及分子改造方面的研究进展,并对级联反应提高手性胺产量的策略作了进一步讨论。最后,本文简要总结了ω-转氨酶在不对称合成非天然氨基酸中的具体应用。

固定化细胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺研究

采用硅藻土作载体,聚乙烯亚胺和戊二醛作交联剂来固定化E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表达菌株,以此来催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2],考察了硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化细胞的催化性能,进一步优化了固定化细胞催化合成(3R,5R)-2工艺。结果表明:在固定化细胞用量100g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1:1、转化温度30℃、pH7.0、流速12mL/min、100 g/L的(5R)-1转化完全的条件下,填充床式反应器可以连续反应五个批次,转化570 g/L的(5R)-1,较搅拌式反应器提高了107.3%,较游离细胞间歇催化操作提高了185%。

瑞舒伐他汀侧链(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成研究进展

瑞舒伐他汀是一种高效的羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,能有效降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇,且无副作用,被称为"超级他汀".瑞舒伐他汀是由疏水性母核和开环侧链构成,其手性侧链是合成中的难点.目前,化学法和生物酶法合成瑞舒伐他汀关键手性侧链(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯受到研究者广泛的关注.主要介绍了不对称还原合成(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的研究进展.

腈水解酶反应机制与催化性能调控研究进展

腈水解酶是一类能够催化腈类化合物水解生成相应羧酸和氨的酶。因其独特的化学、区域和立体选择性,腈水解酶生物催化在高附加值羧酸等化学品的制备中具有重要应用,代表了原子经济和绿色化学的发展方向,成为生物有机合成中最为活跃的分支之一。本文综述了腈水解酶的来源、催化机制及基于结构功能构效关系的催化性能调控等方面研究进展,展望了腈水解酶的工业应用潜力,为发展腈水解酶设计改造方法、拓展其应用范围奠定基础。

脂溶性维生素的生物合成

维生素是人体正常生命活动所必需的一种有机物质,近年来维生素的应用场景不断扩展,除食品、畜牧业领域外,在医药、美妆等行业也有广泛应用,因此全球市场对维生素的需求不断增长。随着近几年合成生物学的快速发展,在现有的维生素生产方法中生物合成法因具有环保、安全、效率高等优点,逐渐被行业研究者所关注。为了进一步实现低碳、节能、减排以及我国“碳达峰”和“碳中和”的目标,建立和实现生物合成维生素的方法具有较大的应用价值。本文综述了近年来生物合成在维生素生产领域的研究进展,详细阐述了脂溶性维生素(维生素A、维生素D、维生素E和维生素K)的生物合成研究现状。

水溶性维生素的生物合成

维生素是维持生物体正常生理功能所必需的一类有机物质,大部分维生素无法由人体合成,少部分维生素只能有限地合成,无法满足自身需求,因而需要通过摄入含维生素的食物或药品来满足自身需要。近年来,维生素被广泛应用于医药、食品或饲料添加剂、化妆品等行业中,人们对维生素的需求也不断增加。维生素的合成方法可分为化学合成法与生物合成法两大类,相较于化学法,生物法合成维生素具有环境友好、安全性高、成本低廉等优势,因此研究生物合成维生素的方法具有一定应用价值。本文综述了近年来水溶性维生素生产领域中生物合成法的研究进展,总结了水溶性维生素(B族维生素、维生素C)生物合成的研究成果,并对生物合成水溶性维生素的发展进行了展望。

重组短链脱氢酶LcSDR催化(R)-1-苯基乙醇不对称合成的工艺开发

采用基因挖掘技术从Lactobacillus composti基因组中筛选到一条编码短链脱氢酶(LcSDR)的序列,该LcSDR能不对称还原苯乙酮(1a)合成(R)-1-苯基乙醇[(R)-1b]。构建了Lc SDR和葡萄糖脱氢酶(EsGDH)双酶偶联催化合成体系,优化了Lc SDR不对称还原1a合成(R)-1b的催化工艺参数。在较佳催化条件下,50 g/L1a转化反应2 h,产物(R)-1b得率93.8%,产物对映体过量值(eep)高于99%,该手性生物合成催化过程的时空产率达到562.8 g/(L·d)。

耐高温葡萄糖异构酶重组菌发酵与转化条件研究

耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温度28℃,诱导剂终浓度0.1 mmol/L,发酵培养基添加5 mmol/L Mn^(2+)的最优产酶发酵条件;将最优转化体系放大,包括20 g/L湿菌体、10 mmol/L Mn^(2+)和200 g/L底物,于95℃和pH 7.5条件下生物转化4 h,D-果糖得率高达57.34%。该工艺具备一步法生产F55型高果糖浆的可能性,可简化后续浓缩分离等步骤,为进一步使用食品安全的表达系统生产F55型高果糖浆提供理论依据。

米曲霉脂肪酶催化鱼油酯酯交换制备高含量EPA/DHA甘油酯的研究

利用米曲霉脂肪酶催化甘油酯型鱼油和乙酯型鱼油的酯酯交换反应制备高含量EPA/DHA甘油酯,考察了底物摩尔比、反应温度、酶添加量和摇床转速对酶催化反应的影响,得到了最优酶催化反应条件:甘油酯型鱼油与乙酯型鱼油摩尔比1∶3,酶添加量14%,反应温度70℃,摇床转速150 r/min。在最优的酶催化反应条件下反应18 h,产物甘油酯型鱼油EPA和DHA含量可达到39.72%。在优化条件下对米曲霉WZ007菌丝体重复使用6次,甘油酯型鱼油产品中的EPA和DHA含量仍保持在34.51%。

L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用。本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28b-p4h BJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力。通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 m L p H 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/Lα-KG,0.8 mmol/L Fe SO4·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86%。该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-4Hyp奠定了一定的技术基础。

转氨酶的固定化及酶学性质研究

利用环氧树脂载体进行固定化转氨酶的研究,通过单因素优化确定了较优的酶固定化条件:ES-103b树脂载体、转氨酶和辅酶磷酸吡哆醛最佳质量比为50∶6∶5,在p H为7.0的1mol/L磷酸钾缓冲液介质中吸附25 h。将得到的固定化颗粒重新置于pH为9.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中,30℃保温30 h。取出后置于pH为8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液中,25℃保温12 h,制得固定化转氨酶,其比活力为52.7 U/g(湿载体),酶活回收率达到49.3%。酶学性质研究表明:固定化转氨酶催化反应最适pH、温度分别为7.0、50℃;固定化酶热稳定性及p H稳定性明显提高,50℃条件下的半衰期为20.2 d;在pH 8.0的三乙醇胺缓冲液中(4℃),10 d后酶活仍保持初始酶活的82.3%。

耐高温葡萄糖异构酶的全细胞固定化条件研究

对三羟甲基磷交联Thermus oshimai葡萄糖异构酶重组菌的固定化工艺进行研究。确定所用硅藻土载体粒径36.8μm、聚凝剂聚乙烯亚胺分子质量为70 000 Da、交联剂合成前体为四羟甲基硫酸磷;运用最优的固定化条件:0.3 g硅藻土、5 mmol/L Mn^(2+)、0.12%(体积分数)聚乙烯亚胺絮凝1 h、1.5%(体积分数)三羟甲基硫酸磷交联1.5 h,所制备的固定化细胞酶活可达138.4 U/g。应用该催化剂于85℃和1 100 mmol/L D-葡萄糖底物条件下连续催化10批次,催化剂仍保留91%以上酶活,D-果糖转化率始终维持在51.7%以上。该工艺可以连续生产高果糖浓度高果糖浆,有效简化后续分离提取工艺,为进一步使用符合食品工业要求的表达系统连续制备高果糖浆奠定基础。

添加剂提高酶稳定性研究进展

酶作为一种高效的生物催化剂,以其独特的优势广泛应用于化工、医药、食品、能源等各领域。然而,大多数酶在反应时会遇到高温、高盐、极端p H等逆境,容易造成酶的失活,进而降低生产效率,这严重限制其在工业上的推广和应用。因此,强化酶稳定性已成为当前研究的热点和难点。添加稳定剂是一种简单、经济、有效的提高酶稳定性的方法,对几种不同类型添加剂的特点及其在改善酶稳定性方面的应用作了综述,并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。

以甘油为唯一碳源的氧化葡糖杆菌适应性驯化及催化合成米格列醇中间体6NSL

氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)来源的山梨醇脱氢酶可催化N-羟乙基葡萄糖胺合成6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖,即合成降血糖药物米格列醇的关键中间体。本文采用适应性驯化策略,以甘油为唯一碳源,通过40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L甘油梯度连续传代培养,筛选获得了一株以甘油为碳源的高活力菌株G.oxydans A-3-D,扫描电镜结果表明该细胞表面褶皱较原始菌株有显著增加。在80 g/L甘油培养基摇瓶培养24 h后,菌体浓度为4.58 g DCW/L,山梨醇脱氢酶的发酵体积酶活与比酶活分别为原始菌株G.oxydans ZJB-605的1.3倍及1.5倍。此外,在摇瓶培养条件下对影响催化反应进程的关键因素进行了考查,结果表明在摇瓶体系中,G.oxydans A-3-D的最适催化反应条件为80.0 g/L底物、2.0 g DCW/L菌体细胞、20 mmol/L Mg^(2+)浓度,15℃反应48 h后底物转化率达到90.8%,6NSL累积浓度为72.6 g/L,较G.oxydans ZJB-605有显著提升。

微生物醛酮还原酶结构、功能及其在生物催化中的应用

微生物醛酮还原酶(AKR)作为醛酮还原酶超家族的重要构成之一,广泛存在于自然界的各种微生物中,可对一系列天然和非天然的底物进行代谢.通常,微生物AKR是大小约为37 kDa的单体蛋白,具有典型的(α/β)8桶状结构和保守的辅酶结合区域.微生物AKR是NAD(P)H依赖型氧化还原酶,遵循由催化四联体Asp-Tyr-Lys-His推动的强制顺序反应机制.许多微生物AKR被应用于不同的生物转化中,主要包括木糖醇、维生素C前体2-酮-L-古龙酸和各类医药、化工中间体手性醇的合成.