肾综合征出血热的4周龄长爪沙鼠模型

目的 肾综合征出血热长爪沙鼠模型的建立。方法 4周龄左右的长爪沙鼠 ,脑内接种肾综合征出血热 (HFRS)病毒 ,在 - 1、+1、+2、+4天注射环磷酰胺 30mg/kg体重 (第 0天感染病毒 )。结果 沙鼠由隐性感染变为急性致死性感染 ,病死率为 93%。在病死动物的脑、肺、肝、脾和肾等器官中 ,均检查到HFRS病毒抗原。结论 4周龄长爪沙鼠模型可用于本病的研究。

肾综合征出血热I型灭活疫苗免疫的成本效果分析

目的 对肾综合征出血热I型鼠脑疫苗在人群中的预防免疫效果进行卫生经济学评价。方法 利用在疫区现场进行流行病学考核的资料 ,评价疫苗免疫预防对于健康和人群生存质量的影响。分别比较接种疫苗组和非接种组的成本、通过免疫而取得的结果以及成本 -效果比值。所有疾病结局均来自于疫苗效果考核的观察。疫苗覆盖率、成本等资料来自现场收集的资料。结果 按目前免疫程序 ,HFRS灭活疫苗在人群中的有效率约 90 %。在所有年龄组人群中每减少 1名出血热病例的费用为 9773.2 8元。成本 -效果比值因不同年龄组而异 ,其中 30～ 39年龄组每增加 1个健康生命年需花费 12 0 88.6 9元 ,5 0～ 5 9岁年龄组每增加 1个健康生命年需花费 6 2 2 93 .12元。疫苗成本、保护期和保护率对成本 -效果比值最为敏感。结论 疫苗在所有年龄组易感者中均未能获得正效益 ,但在 30～ 39岁的高危人群中能取得最佳的成本 -效果比。

肾综合征出血热疫苗交叉加强免疫抗体应答水平

目的 研究在肾综合征出血热 (HFRS)双价灭活疫苗基础免疫的基础上 ,1年后分别用双价苗和Ⅰ型、Ⅱ型单价苗分别进行加强免疫 ,以观察不同型别疫苗加强后机体的抗体应答水平及区别 ,以确定加强疫苗剂型。方法 对 2 0 6名疫苗接种者中的部分接种者 ,在基础免疫后 2周及 1年后 (加强前 )和加强后 2周、1年分别采集血清 ,以间接免疫荧光试验 (IFA)和微量细胞病变中和试验 (MCPENT)检测IFA -IgG抗体和中和抗体。 结果 ( 1)基础免疫后2周IFA -IgG抗体阳转率为 96 76% ,GMT为 3 8 0 5 ;中和抗体阳转率 :Ⅰ型为 10 0 % ,Ⅱ型为 92 5 0 % ;中和抗体GMT :Ⅰ型为 2 0 82 ,Ⅱ型为 15 66。 ( 2 )基础免疫后 1年 (加强前 )IFA -IgG抗体阳转率降为 5 1 91% ,GMT也降到2 5 45 ;中和抗体阳转率 :Ⅰ型为 5 5 81% ,Ⅱ型为 46 5 1%。中和抗体GMT也分别降到 5 45和 5 18。 ( 3 )加强免疫后 2周IFA -IgG抗体阳转率回升到 98 46% ,GMT也上升到 3 8 0 2 ;同时中和抗体性率 :3组两型抗体均为 10 0 %阳转 ;Ⅰ型抗体GMT分别为 2 0 0 1,46 66和 12 42 ;Ⅱ型抗体和GMT分别为 2 0 0 0、19 99和 16 82。结论 在双价疫苗基础免疫的基础上 ,通过 3种疫苗加强免疫 ,产生的IFA抗体和中和抗体在阳性率和GMT水平 3组间很接近 ,?

3株肾综合征出血热病毒的分离和鉴定

目的了解浙江省肾综合征出血热(HFRS)流行特点及汉坦病毒(HV)型别,为防治提供科学依据。方法鼠肺HV抗原检测采用直接免疫荧光法(DFA),病毒分离采用阳性鼠肺研磨液接种幼龄长爪沙鼠,再经Vero-E6细胞传代,用单克隆抗体DFA鉴定毒株及分型。结果从捕自浙江省龙泉地区的8份阳性鼠肺中分离到3株HV,经DFA鉴定均为汉滩型(Ⅰ型)病毒,3株病毒在Vero-E6细胞中的感染滴度为104.75～105.25CCID50/ml。结论从鼠类肺组织中分离到3株汉滩型HV,毒株均能在Vero-E6细胞中较好增殖,有可能成为HFRS疫苗后备毒株。

人用H5N1禽流感疫苗免疫动物效果观察

目的将用禽流感毒种R1203株按3种生产工艺生产的疫苗进行动物接种,观察疫苗的免疫效果。方法用不同剂量的3种工艺生产的禽流感疫苗,分别免疫大鼠和家兔,肌肉接种2针(隔14 d),首针后14和28 d静脉采血,测定接种1针和2针后,动物血清中血凝抑制抗体和中和抗体的产生情况。结果大鼠的抗体反应较家兔敏感;大鼠和家兔在疫苗接种1针后14 d,都能产生血抑抗体,滴度可达1∶40,但中和抗体滴度都很低,几乎测不到;接种2针后,血抑抗体或中和抗体反应都显著高于第1针;裂解-2苗接种大鼠和家兔后的抗体反应普遍高于另2种疫苗,且家兔量-效反应明显。结论裂解-2疫苗优于其他2种;中和抗体能正确反应疫苗的质量;H5N1禽流感疫苗的效力试验可用于免疫家兔测定中和抗体和临床前研究的动物试验,用15μg血凝素(HA)接种家兔2针,血清中和抗体滴度达1:40或以上。

浙江省蚊虫中乙型脑炎病毒的分离及鉴定

目的 对2007年浙江省采集的蚊虫标本进行病毒分离与鉴定。方法 2007年在浙江省采集蚊虫标本，用金黄地鼠肾细胞（BHK-21）分离病毒，对新分离的病毒进行血清学和分子生物学鉴定。结果 采集到4735只蚊虫，分离到2株致BHK-21细胞病变的病毒，经免疫荧光和RT—PCR试验鉴定为乙型脑炎病毒（JEV），利用病毒PrM区段进行基因分型分析，新分离的2株病毒属于基因I型JEV。对这2株病毒的E基因区段进行分析，核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．8％。与疫苗株SA14—14—2相比，核苷酸同源性在87，7％，氨基酸同源性在96．4％以上，共有14个共同的氨基酸位点差异。结论 在浙江省采集的蚊虫标本中分离到2株病毒，经鉴定为基因I型JEV，是浙江省近年来首次分离。

人用H5N1禽流感裂解疫苗的制备工艺

目的设计3种工艺,制备不同裂解程度的禽流感疫苗,并观察其免疫效果。方法用禽流感毒种R1203株制备3种禽流感疫苗(全病毒、裂解-1和裂解-2),并分别以不同剂量免疫大鼠和家兔,肌肉接种2针(间隔14d),初免后14d和28d静脉采血,检测动物血清中血凝抑制抗体和中和抗体。结果两种动物在疫苗接种1针后14d,血抑抗体和中和抗体滴度均较低;接种2针后14d,均显著高于1针;裂解-2疫苗接种两种动物后的抗体反应均高于其他两种疫苗,且家兔的中和抗体量-效反应明显。结论裂解-2疫苗的工艺优于其他两种疫苗,其中和抗体能正确反映疫苗的质量。

人用H5N1禽流感疫苗检定评价

目的选用H5N1禽流感毒种(R1194和R1203),按设计的生产工艺,制成的疫苗进行全面检定,选取其中较好毒株生产的疫苗,用于以后人用禽流感疫苗临床前研究的动物免疫。方法利用从国外引进2株H5N1禽流感病毒,设计生产3种疫苗(全病毒、裂解-1、裂解-2)的纯化工艺,优化纯化条件,全面检定制成的疫苗,比较2毒种生产疫苗的质量。结果2毒株在接种滴度104EID50/ml(半数鸡胚感染剂量/ml),培养温度34.5℃,培养时间3 d的条件下,病毒增殖滴度较高;检定结果证明,制成的所有疫苗中反映质量的内毒素、卵清蛋白、总蛋白、总蛋白与血凝素之比这4项指标,明显优于国家标准;3种工艺疫苗的电镜形态完全不同;经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),全病毒疫苗和裂解-2疫苗的蛋白条带形态相似,但裂解-1疫苗在32 KD左右的条带缺失;毒种R1203株疫苗的产量明显高于R1194株。结论设计的3种生产疫苗的纯化工艺,均可生产出高质量的疫苗;毒种R1203株的疫苗产量高于毒种R1194株;可用R1203毒株,按3种不同工艺生产的疫苗接种动物,观察免疫效果。

浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点

目的了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎（乙脑）病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别。方法于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清，共采集10662只蚊虫和204份猪血清，蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主。利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测蚊虫携带乙脑病毒，应用酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）方法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT—PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定；利用RT—PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因，并对细胞分离到的病毒进行基因分型。结果在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本，并分离出3株病毒，经鉴定3株病毒均为乙脑病毒，基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。猪血清有121份阳性，总阳性率为59．3％。6月份有50％以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性。结论浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介，在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒；采集的蚊虫标本中分离到3株病毒，经鉴定为基因I型乙脑病毒，是近年来在浙江省首次分离到的基因I型乙脑病毒。

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料，研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度，为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据。方法设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因，PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定。通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒XJ69和XJP613株全基因组全长均为10964个核苷酸，含有一个开放阅读框架，编码3432个氨基酸。与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸同源为83．5％～99．2％，氨基酸总体同源性为97．5％～99．7％。通过PrM／C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因I型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型，与上海三带喙库蚊分离株sH17M-07关系最为接近。

汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析

目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 616个核苷酸,编码1 135个氨基酸。S全基因序列含有1 700个核苷酸,编码429个氨基酸。经核苷酸与氨基酸同源性分析,Z5株应属于汉坦病毒的汉滩型(HTN型)毒株,与Z10株同属一个亚型。结论Z5株病毒和其他汉滩病毒病毒在核苷酸序列上有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高。

人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立

目的为了研制人用H5N1禽流感疫苗,按照《中国药典》三部“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”中的要求,建立用于生产禽流感疫苗的毒种库。方法从国外引进2株H5N1禽流感疫苗的毒种(R1194和R1203),进行全面检定,建立三级种子库,即原代、主代和工作代,用于疫苗生产。结果引进的R1194和R12032个毒株能在胚蛋中大量增殖并稳定传代;与普通流感A1,A3,B作交叉血凝抑制试验和交叉单向免疫扩散试验表明,符合H5N1禽流感病毒的特征;经对血凝素序列测定,证实了引进的2毒株为H5N1禽流感病毒;测得的序列与原始株序列比较可知,2毒株均已去除有毒基因,属弱毒株;确定2毒株的P2为原代,P4为主代,P5为工作代。结论引进的R1194和R1203毒种为H5N1禽流感减毒株,可用于禽流感疫苗的生产。

Ⅱ型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。

H5N1人用禽流感疫苗免疫原性检测方法的建立

目的确定人用禽流感疫苗免疫原性检测方法。方法用禽流感病毒R1203株制备疫苗,以不同剂量免疫家兔,检测血清中的血凝抑制抗体和中和抗体,并进行交叉血凝抑制试验、交叉单向免疫扩散试验和交叉中和试验。结果R1203株疫苗接种家兔1针后14 d,中和抗体和血抑抗体滴度均较低;第2针后14 d均明显升高。血抑抗体量-效反应不明显,而中和抗体量-效反应明显。交叉血凝抑制试验显示,异型之间普遍有交叉反应,滴度大部分不低于1∶40。单向免疫扩散试验显示异型之间无交叉反应。禽流感疫苗抗血清不能中和人流感病毒,但能中和同型病毒(R1194),滴度可达1∶240。结论中和抗体能正确反映疫苗的免疫原性;检测中和抗体的方法可用于禽流感疫苗的效力试验。

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对蚊虫样本的检测，以评价该方法的实际应用价值。结果优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0．1gmol／L探针浓度，0．2gmol／L引物浓度，5mmol／L Mg^2＋浓度。结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性，对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒（SEO型与HTN型）均无交叉反应，检测的灵敏度达0．1TCID50，重复性分析表明同一样品Ct值的重复检测4次，其标准差均在合理范围内，分别为0．033、0．079、0．149和0．411。对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离检测，结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性，而病毒分离则只检测出3份阳性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感，可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，且操作简便、敏感性高。结论研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于乙脑病原学的快速检测。

组氨酸激酶Ⅱ在伯氏疏螺旋体生活史中的功能

目的伯氏疏螺旋体组氨酸激酶Ⅱ(Hk2)和反应调节蛋白Rrp2共同组成一个二元信号系统,控制病原菌侵染哺乳动物所需致病因子的表达,但Hk2的生物学功能有待验证。方法应用同源重组方法得到hk2敲除菌株(hk2-),并利用蜱-鼠动物模型对其生物学功能进行探索。结果 hk2-能够通过人工针刺正常感染小鼠,间接免疫荧光试验显示在吸血的幼蜱和若蜱中肠能够检测到hk2-,定量PCR结果显示hk2敲除并不影响病原菌在若蜱中肠的繁殖,但在蜱叮咬状态下只有50%的小鼠能够被hk2-感染。结论Hk2不影响病原菌从鼠传播到幼蜱及随后在蜱体内的长期寄生,但hk2敲除降低了病原菌在自然条件下(蜱叮咬)感染小鼠的能力,研究结果暗示Hk2在病原菌生活史中的功能是协助病原菌高效地侵染哺乳动物。