浙江省麻疹病毒流行株血凝素基因的变异及其与国内外流行株的差异

目的探讨浙江省麻疹病毒（measlesvirus，MV）流行株血凝素基因的变异情况，及其与国内外流行株的差异。方法选取浙江省1999-2011年分离保存的麻疹病毒流行株33株，提取病毒核酸，采用RT-PCR法扩增其血凝素（H）基因全序列，并与GenBank上下载的中国麻疹疫苗株沪191，以及95株国内外各基因型麻疹毒株的H基因序列进行比较分析。结果从浙江省1999-2011年麻疹患者咽拭子标本中分离麻疹病毒株33株，与1993-2007年我国其他地区麻疹流行株构建H基因系统进化树，结果表明33株浙江麻疹流行株均属于H1a亚型，流行株分布无明显时间和地域特征。以疫苗株沪191为参考株，我国2003-2011年H1a亚型流行株H基因的核苷酸、氨基酸平均变异率以及进化率分别为5．15％、4．44％和5．81％，分别高于1965-1993年（4．75％、3．86％和5．30％），以及1994-2002年（4．80％、4．08％和5．37％）流行株平均变异率与进化率；3个时间段流行株H基因非同义替换率与同义替换率的比值（dn／ds）分别为0．19、0．21和0．23，表明1993-2011年我国H1a型麻疹流行株尚未受到明显的正向选择作用。我田2003-2011年H1a亚型毒株与沪191之间，在H基因上共存在24个稳定的氨基酸变异位点；H1a亚型流行株与A基因型疫苗株间差异最大，遗传距离为0．053，氨基酸差异数为26～28个，而B3、D4型代表株与沪191间稳定的氨基酸差异仪为15个。另外，H1a型流行株与B、D基因型毒株间差异明显，组间遗传距离分别为0．074和0．071，氨基酸差异数达27～33个。结论麻疹病毒H1a亚型流行株与疫苗株以及其他基因型麻疹病毒株，在H基因上存在明显差异，且该差异随时间累积而增大，应该引起足够的重视。

浙江省2005-2010年风疹病毒分子流行病学研究

目的分析2005--2010年浙江省风疹病毒流行株的病原学与分子流行病学特征。方法采集该期间风疹疫情中的疑似患者标本，于Vero细胞上分离病毒。采用巢式RT-PCR扩增流行株E1、E2和C三个结构基因片段，对扩增产物进行序列测定与分析。结果从52例临床标本中共分离到风疹病毒流行株7株，除RVi／Zhejiang．CHN／23．08株为2B基因型外，其余6株均属于1E基因型。基因进化树上，1E基因型流行株分别与香港、海南地区流行株具有最近亲缘关系，而2B基因型流行株与BuenosAires．ARG／46．08位于同一分支。遗传距离分析表明，浙江2B型流行株与全球其他地区流行株间的遗传距离（0．011）小于与中国流行株（0．023）间的遗传距离。浙江风疹流行株与中国风疹疫苗株BRDⅡ在核苷酸水平上的同源性为C〉E2〉E1，而氨基酸水平上的同源性为E1〉C〉E2，对应存在3、11和23个氨基酸的变异。各位点氨基酸熵值表明，E1蛋白上仅存在一个易变位点（熵值〉0．600），而E2蛋白上有7个易变异位点和1个高变异位点（熵值〉1．000）。结论2005--2010年浙江省存在两种基因型风疹病毒流行，1E为优势基因型，2B可能为境外输入株。流行株E1基因氨基酸序列相对保守，而E2基因氨基酸变异较大，在风疹病毒流行病学监测中除关注E1基因外，应开展对结构基因E2和C的研究。

2005-2010年浙江省腮腺炎流行株与疫苗株S79全基因组序列比较分析

目的比较浙江省腮腺炎流行株与疫苗株S79的全基因组序列差异。方法选择浙江省于2005-2010年分离得到的4株腮腺炎流行株进行研究，分别为ZJ05．1、ZJ06-3、ZJ08．1和ZJ10-1。采用RT-PCR法扩增流行株全基因序列，并与疫苗株S79及其他基因型毒株序列进行比对，计算遗传距离及进行进化分析。结果4株腮腺炎流行株与疫苗株S79在膜相关蛋白基因上差异率最大，核苷酸平均差异数为42．5±3．0，平均差异率为13．6％，氨基酸平均差异数为12．8±1．5，平均差异率为22．4％；而在基质蛋白基因上的差异率最小，核苷酸平均差异数为73．83-2．5，平均差异率为5．9％，氨基酸平均差异数为3．0±0，8，平均差异率为0．8％。4株流行株的膜相关蛋白基因的dn／ds值最大，已达0．6526，但仍未受到正向压力（dn／ds〈1；）（2=0．87，P〉0．05）。流行株在已知的抗原表位如膜相关蛋白基因第8位氨基酸，以及血凝素／神经氨酸酶蛋白基因第336与356位氨基酸上均存在变异。与疫苗株相比较，ZJ05-1、ZJ06-3、ZJ08-1和ZJ10-1的糖基化位点各增加了1、1、2和2个。各基因型毒株氨基酸全序列比较表明，F基因型腮腺炎流行株可能存在17个特征性位点。在全基因组上，浙江省腮腺炎流行株与疫苗株的组间遗传距离（0．071）明显大于与云南株的组问遗传距离（0．013），差异有统计学意义（t：4．14，P〈0．05）；除核壳蛋白基因外，其余各个基因构建的进化树均类似。结论浙江省腮腺炎流行株与疫苗株在各个基因上均已产生了一定的差异。

浙江省1998年H3N2流感流行的溯源研究

目的对1998年浙江省的H3N2流感流行进行溯源研究。方法采用RT-PCR扩增浙江省1998年3株H3N2流感流行代表株的全基因组序列，并与GenBank上1995～1998年世界其他地区H3N2流感流行株进行比较；同时，采用交叉血凝抑制实验，计算各毒株间的抗原比。结果HA基因进化树表明，1998年浙江省H3N2优势流行株A／Zhejiang／11／98、A／Zhejiang／18／98与1995—1996年世界各地以及1997年我国大陆的H3N2流行株间存在显著差异，在进化树上虽与A／Sydney／5／97同属一簇，但和美国纽约以及巾同香港1997年后期流行株更为接近。在HAl、NA和MP基因上，A／Zhejiang／18／98与香港1997年后期流行株同源性最高，而在PA、HA和NS基因上，与纽约流行株的遗传距离也小于A／Sydney／5／97。A／Zhejiang／18／98与香港或纽约株在HAl区仅存在1～3个位点的氨基酸残基不同，而与A／Sydney／5／97存在7个位点的氨基酸残基差异，其中3个位点于抗原决定簇区。各毒株间的交叉血凝抑制实验表明A／Zhejiang／18／98与A／Sydney／5／97的抗原比已达2．0，提示二者在抗原性上存在一定差异。此外，1997—1998年H3N2各地流感流行的起始时间序列，也显示了该次流感传播的可能途径。结论浙江省1998年H3N2流感的流行很可能是由1997年底H3N2新型流感变异株经细约和香港输入中国大陆所导致。

浙江省2002-2010年急性出血性结膜炎暴发疫情病原体CA24v的全基因组序列分析

目的分析2002--2010年浙江省急性出血性结膜炎（AHC）暴发疫情病原柯萨奇病毒A组24型变种（CA24v）流行株的全基因组序列与遗传特性。方法选取浙江省不同年份的CA24v流行株，采用RT-PCR扩增基因序列，并与国内外流行株进行全基因组及VPl、3C区序列比较分析。结果浙江省2002年和2010年CA24v全序列为7456～7458bp，编码含2214个氨基酸残基的多聚蛋白，2010年的Zhejiang／08／10较2002年的毒株在5’端非编码区的第97、119位各存在一个T碱基插入，Zhejiang／08／10与2002年以来的分离株各区段氨基酸同源性为94．7％～100．0％，与近60年来CA24流行代表株全序列中各区段氨基酸的平均差异率以2A区与3A区最大，分别达8．4％和7．3％，3D区最小，仅为1．9％。1987年与2002年以来的CA24v毒株在全序列上共存在38个和20个氨基酸的稳定变异。2002--2010年CA24v的组间遗传距离分析表明，3C区较VP1区更为稳定，CA24v的早年流行株Jamaica／10628／87在3D区上可能存在重组，而在近年流行株中未发现该现象。结论CA24v以时间序列为主逐年进化，地域间虽存在差异，但影响较小。自2002年起，由CA24v引起的AHc一直在浙江省本地散在流行。

2005年浙江麻疹流行株与疫苗株基因组比较分析

目的通过对麻疹暴发疫情中分离的麻疹流行株MVi／Zhejiang．CHN／7．05／4与麻疹疫苗株沪191全基因组比较，分析当代麻疹流行株与疫苗株的基因差异。方法通过测定从2005年浙江省麻疹暴发疫情中分离到的麻疹流行株MVi／Zhejiang．CHN／7．05／4的全基因组序列，采用MEGA3．1软件对流行株与疫苗株的全基因组序列进行比对和分析，并结合流行病学资料对毒株的变异进行分析。结果流行株与疫苗株相比全基因组共发生822个碱基突变（变异率为5．17％），含161个异义突变，其中有3个变异位点导致了病毒糖基化位点的变异；用毒株制备抗血清进行交叉中和试验，流行株与疫苗株抗原比相差5．66倍。结论浙江省2005年麻疹暴发疫情分离的流行株MVi／Zhejiang．CHN／7．05／4和中国现行使用的麻疹疫苗株沪191在全基因组层面已存在一定的差异，疫苗对免疫人群的保护作用需做进一步追踪探讨。