TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。

浙江省2008-2009年三起诺如病毒胃肠炎暴发的病原分子特征分析

目的分析浙汀省3起病毒性胃肠炎暴发疫情的诺如病毒分子特征。方法收集监测期间病毒性胃肠炎暴发疫情患者的粪便标本，采用荧光定量RT-PCR方法检测诺如病毒，并选择部分阳性标本扩增部分多聚酶区（RdRp）和衣壳蛋白区，同时采用3’RACE（rapid amplification of cDNA 3’ends）扩增诺如病毒基因组3’末端，获得完整的开放读码框架（ORF）2和ORF3序列。结果3起暴发疫情共检测标本62份，诺如病毒阳性41份，其中诺如病毒Ⅰ（GⅠ）基因组阳性27例，Ⅱ基因组（GⅡ）阳性9例，GⅠ＋GⅡ阳性5例。结果显示，引起浙江省2008—2009年3起病毒性胃肠炎暴发疫情的诺如病毒具有病毒基因型的多样性，包括GⅠ．8、GⅡ．b、GⅠ．2与GⅠ．6重组株、GⅠ．8和GⅡ．b混合感染。结论诺如病毒是浙江省病毒性腹泻暴发疫情的重要病原体，呈现出病毒基冈型的多样性，并在省内首次检测到诺如病毒的重组和混合感染毒株。

浙江省2006-2007年暴发性胃肠炎中诺如病毒的分子流行病学分析

目的分析浙江省2006-2007年暴发性病毒性胃肠炎中诺如病毒感染的分子流行病学特征。方法收集监测期间暴发性病毒性胃肠炎疫情患者的粪便标本及相关流行病学资料。采用RT-PCR及荧光定量RT-PCR检测诺如病毒。随机选择部分阳性标本扩增部分多聚酶区和衣壳蛋白片段，进行序列测定，结合诺如病毒I（GI）、Ⅱ（GⅡ）基因型参考株进行进化分析。结果诺如病毒感染暴发性胃肠炎共5起，发生时间均集中于9-12月，送检标本63份，诺如病毒检测阳性45份。序列分析结果显示，浙江省诺如病毒序列与诺如病毒GⅡ／4型参考株同源性最高，其中与北京2006年、荷兰2006年诺如病毒GⅡ／4型变异株最为接近，核苷酸同源性分别为99.7％和98.5％-99.0％。诺如病毒与北京、荷兰流行的GⅡ／4型变异株处于同一分支。结论诺如病毒是浙江省病毒性腹泻暴发疫情的重要病原体，流行时间集中于秋季，其流行株为GⅡ／4型变异病毒株。

1998-2009年浙江省H3N2亚型流行性感冒病毒全序列变异的研究

目的比较1998-2009年浙江省H3N2业型流行性感冒（简称流感）流行株HA基因进化与全基因进化状况的一致性，并探讨全基因组序列上可能存在的潜在抗原区域。方法选择浙江省CDC流感实验室于1998-2009年流感疫情中分离保存的H3N2亚型流感流行代表株19株，采用RT—PCR法进行全基因组序列扩增，并将这些毒株与10株同期H3N2亚型流感疫苗株进行全序列及HA1基因的系统进化比较；通过氨基酸替换比较、熵值计算及正向选择位点的筛选，确定各基因上的氨基酸易变位点。结果H3N2亚型流感病毒的全序列长度为4466个氨基酸，其中有137个氨基酸位点发牛稳定变异。在HA基因上第144和158位氨基酸分别经历了4次和3次替换，NA基因的第93、143、307、370、372位氨基酸和NP基因的第450位氨基酸经历了2次替换，且HA基因和NA基因上分别有29％（12／41）和77％（24／31）的变异位点位于已知抗原决定簇之外的区域。氨基酸位点熵值分析显示，HA基因非抗原决定簇的3、225、361位，NA基因非抗原决定簇的93、143、147、150、372位，PB1基因的113、576、586位，朋基因的101、256、382、421、437位，NP基因的377、450位，M1基因的218位及M2基因的31位氨基酸均为易变位点。结论浙江省1998-2009年H3N2业型流感病毒在HA和NA已知抗原决定簇之外的区域与部分内部基因上，可能存在着一些尚未被发现或者新形成的抗原位点。与HA基因的系统进化比较，全序列能更为伞面地反映出流感流行株之间的亲缘关系与进化规律。

汉坦病毒与宿主线粒体D-loop和cyt b基因共进化分析

目的比较汉坦病毒(HV)抗原阳性和阴性的宿主动物线粒体D环区(D-loop)和细胞色素b(Cyt b)基因序列变化及与HV共进化的关系。方法采用直接免疫荧光法检测715份宿主动物鼠肺HV感染情况,提取HV抗原阳性和阴性黑线姬鼠鼠肺组织总DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增宿主动物线粒体的D-loop和Cyt b基因,PCR产物纯化后测定序列,应用Clustal X生物学软件进行多重序列同源性分析,M ega软件绘制系统发生树进行分析比较。结果 HV抗原检测阳性和阴性鼠的遗传距离较小,阳性和阴性鼠的D-loop和Cyt b基因均有分布在同一个分支上。结论 HV感染与否与宿主线粒体基因无直接联系。

急性出血性结膜炎病原学分子特征分析

目的检测分析引发浙江省急性出血性结膜炎(AHC)爆发流行的病原学及毒株的分子特征。方法采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法直接从AHC患者眼拭子样本中检测肠道病毒(EV)和柯萨奇病毒A24变异株(CA24v)核酸;用Hep-2细胞分离病毒,对阳性分离物扩增病毒VP1基因和3C区片段,测定核苷酸序列,应用DNA-MAN和MEGA软件进行同源性和进化分析。结果 3株浙江CA24v分离株VP1基因全长915个核苷酸(nt),3C区全长549 nt,均没有nt的插入和缺失;浙江分离株Zhejiang/13/08与CA24v原型株EH24/70在VP1和3C区核苷酸同源性分别为85.3%和86.5%,与2005年新加坡分离株Singapore/DSO-26/05和2007年广东分离株Guangdong/332/07株在VP1区和3C区的核苷酸同源性分别为97.0%～99.1%和96.7%～99.5%;浙江CA24v分离株在3C区进化树的Ⅲ基因亚型B分支上(GⅢ/B),在VP1进化树的CA24v Group2分支上。结论引起2007-2008年浙江省急性出血性结膜炎爆发流行的病原为CA24v GⅢ亚型,该病毒最有可能来源于新加坡。

金黄色葡萄球菌污染冰淇淋的调查

目的通过冰淇淋及其各种原料和生产线样本分离、培养金黄色葡萄球菌，分析分离株的分子分型和表型特征，对金黄色葡萄球菌污染冰淇淋进行调查。方法采集冰淇淋及其各种原料和生产线投料口、切片机出口、成品托盘等样本，用国标方法分离、培养、鉴定金黄色葡萄球菌，VITEK32生化验证，Mini-Vidas检测分离株肠毒素（多克隆肠毒素SEA-SEE），PCR检测分离株肠毒素基因（肠毒素SEA．SEJ基因），VITEK32测定分离菌株抗生素的耐药性，脉冲凝胶电泳（PFGE）分析菌株间的基因指纹图谱特征。结果分别从冰淇淋和切片机出口分离到2株金黄色葡萄球菌。它们都含有肠毒素（多克隆肠毒素SEA-SEE），都有SEC、SED、SEG、SEH、SEI和SEJ肠毒素基因，耐药谱相同，脉冲凝胶电泳（PFGE）的指纹图谱相同。结论污染冰淇淋和切片机出口的金黄色葡萄球菌是同一克隆株，切片机出口的污染导致冰淇淋污染。