淫羊藿苷对急性肾损伤向慢性肾脏病转化小鼠模型的预防性保护作用

目的·探究淫羊藿苷在急性肾损伤(acute kidney disease,AKI)向慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)转化中的作用并探讨其可能的机制。方法·C57BL/6小鼠腹腔注射马兜铃酸2周,制作AKI向CKD转化模型,并于造模前1周或马兜铃酸注射2周结束时持续灌胃给予淫羊藿苷5周或2周。监测小鼠肾功能和肾脏病理损伤,并用透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞线粒体结构,采用荧光定量PCR(qPCR)及免疫组织化学染色法检测脂肪酸氧化代谢通路、纤维化及炎症指标等。采用Transwell细胞小室共培养大鼠肾脏成纤维细胞株和大鼠肾小管上皮细胞株,模拟2种细胞之间的相互作用。先提前1 h在肾小管上皮细胞培养液中加入淫羊藿苷,再加入马兜铃酸干预24 h;去除药物干预后,将肾小管上皮细胞与成纤维细胞共培养24 h。qPCR或Western blotting检测肾脏上皮细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptorα,Ppara)、促纤维化因子、炎症因子、活化胱天蛋白酶(cleaved caspase-3),以及肾脏成纤维细胞细胞外基质相关基因mRNA或蛋白表达的变化。用Ppara-siRNA转染肾小管上皮细胞,观察淫羊藿苷提前于马兜铃酸干预后PPARα下游线粒体脂肪酸氧化代谢相关指标以及cleaved caspase-3的表达变化。结果·马兜铃酸注射2周结束时和注射结束后2周(造模4周),仅注射马兜铃酸的小鼠血清肌酐及尿素氮水平较对照组均显著升高,肾脏炎症细胞大量浸润,肾小管损伤严重;而提前给予淫羊藿苷干预的小鼠较马兜铃酸组肾功能明显改善,肾脏病理损伤减轻。造模4周时马兜铃酸组肾小管上皮细胞线粒体结构损伤严重,脂肪酸氧化代谢通路相关基因mRNA水平较对照组显著降低,伴巨噬细胞浸润及肾纤维化,提前给予淫羊藿苷干预后上述损伤或指标均明显缓解。在马兜铃酸注射2周结束时给予淫羊藿苷的小鼠血清肌酐和尿素氮水平、肾脏病理损伤、纤维化指标均与马兜铃酸组无明显差异。体外实验中,马兜铃酸可抑制肾小管上皮细胞Ppara mRNA表达,促进cleaved caspase-3、炎症因子及促纤维化因子表达升高,并上调共培养的肾脏成纤维细胞细胞外基质相关基因的表达,而淫羊藿苷提前干预对上述变化有明显的纠正作用。用siRNA敲低肾小管上皮细胞的Ppara后,淫羊藿苷对马兜铃酸抑制脂肪酸氧化代谢及促进细胞凋亡的预防保护作用减弱。结论·淫羊藿苷能预防马兜铃酸诱导的小鼠AKI向CKD转化;它可能是通过改善肾小管上皮细胞线粒体脂肪酸氧化代谢通路(尤其是PPARα)发挥作用。