一种基于液相基因芯片技术对甲型和乙型流感病毒分型检测方法的建立

目的建立能够对甲型流感病毒(influenza virus A,INFA)和乙型流感病毒(influenza virus B,INFB)进行区分的液相基因芯片技术,为甲型和乙型流感病毒的分型提供一种高通量、高灵敏度的检测和鉴定方法。方法从NCBI的Gen Bank下载具有代表性的流感病毒基因组序列,利用生物信息学软件Bio Edit进行序列比对,分别设计针对INFA和INFB的简并引物和特异性探针,将设计好的引物和探针与Gen Bank中所有的基因序列进行比对,以验证其特异性。经探针合成、悬浮液相芯片制备和检测条件的优化获得用于甲型和乙型流感病毒分型的液相基因芯片。结果所检测INFA和INFB均可获得特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显,将2种病毒混合,模拟混合病毒感染也可以得到相应的特异性杂交信号。灵敏度评估结果表明INFA的检测灵敏度为1~10空斑形成单位(plaque forming unit,pfu),而INFB为10~100 pfu。将本方法用于检测11份临床样本,其结果与荧光定量分型逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法的结果一致。结论本研究初步建立了INFA和INFB的液相基因芯片检测技术,可用于流感病毒的初步筛查和鉴定,并且可以进行混合感染样本的检测,为流感病毒的分型和鉴定提供了一种新的手段。

一种基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的温州病毒检测方法的建立

目的建立一种温州病毒(Wenzhou virus,WENV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测方法。方法分析WENV保守区域并设计特异引物,以特异扩增产物构建的阳性重组质粒为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,获得标准曲线。结果建立的WENV的荧光定量PCR标准曲线在1×10~1~1×10~8拷贝/μl的浓度时呈现良好线性关系,其扩增相关系数为0.999,熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,检测下限可达10拷贝。利用WENV的样本对本检测方法进行验证,结果良好,组内变异系数为1.47%。讨论本实验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可用于WENV的诊断及病原的定量分析。

一种基于实时荧光定量PCR的寨卡病毒检测方法的建立

目的建立一种基于实时荧光定量PCR技术的寨卡病毒检测方法。方法根据代表性亚洲型、非洲型寨卡病毒株NS5基因序列,设计特异性引物ZK-1F/R、ZK-2F/R;利用PCR、Real-time PCR方法对引物特异性、灵敏度、可重复性进行评价和优化;利用寨卡病毒感染细胞对本方法进行验证。结果 PCR结果表明两对引物的特异性良好,其Real-time PCR检测灵敏度分别为1.0×103copies/μL和1.0×101copies/μL,扩增效率分别为0.68和0.90,说明引物ZK-2F/R的综合效果优于ZK-1F/R,通过优化实验条件建立基于引物ZK-2F/R的实时荧光定量PCR检测方法,对含有寨卡病毒PRVABC59株和MR766株的样本进行检测,结果分别为9.0×104copies/μL、8.5×104copies/μL。结论本研究建立了一种检测寨卡病毒的方法,可用于临床患者ZIKV感染的检测和预防。