中国恙虫病流行及临床研究进展(2010-2020)

恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)感染引起的急性发热性疾病。主要通过恙螨幼虫叮咬传播,啮齿类动物在恙虫病传播过程中发挥重要作用。随着气候变化和人类活动范围的扩大等原因,我国恙虫病感染病例数和流行区域呈明显增加和北扩趋势。本文基于文献总结分析了2010~2020年我国各地区恙虫病发病情况、流行病学特征、临床研究等进展。结果表明Kato、Karp、Gilliam型为我国恙虫病东方体主要流行基因型;恙虫病在我国各地区均有分布,其中云南、广州、福建等地是高发区;传播媒介种类呈明显地理差异;本病发病高峰期与季节温度、人群年龄、职业等相关。对我国恙虫病流行趋势变化、人群感染风险、环境影响等因素的研究,将为优化媒介防控措施、完善临床诊治方案、提高突发疫情的应急处置能力及精准防控策略的制定提供科学的指导。

曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I(SmCaMK I)基因的生物信息学分析与表达鉴定

目的开展SmCaMK I(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I)的潜在生物学特征分析和功能研究。方法利用相关网站和软件对SmCaMK I的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测。此外,SmCaMK I进行扩增,并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化,制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析。结果 SmCaMK I是一个全长基因,由1 068bp组成,编码355个氨基酸。SmCaMK I与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK I保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89%和88%,与人的CaMK I氨基酸序列一致性仅仅只有44%。分子进化树分析中SmCaMK I与绦虫属的亲缘关系最近,与其他物种亲缘性较远。与人类CaMK I相比,淋巴细胞表位具有统计学差异。SmCaMK I能够定位在成虫的睾丸和虫卵,在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表。结论SmCaMK I是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子,还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白。

曼氏迭宫绦虫cathepsin L样蛋白酶的生物信息学分析

目的通过生物信息学预测曼氏迭宫绦虫cathepsin L样蛋白酶(Smcathepsin L样蛋白酶)的生物学特征及其潜在功能和结构,为下一步Smcathepsin L样蛋白酶参与寄生虫和宿主相互作用过程研究提供依据。方法通过NCBI的ORF finder工具对Smcathepsin L样蛋白酶的开放阅读框(ORF)进行分析,利用Ex PASy网站进行蛋白的物理化学参数、信号肽、跨膜螺旋和潜在分子生物学功能的预测,通过NCBI/BLAST对蛋白保守功能域进行预测。从NCBI网站获取不同物种的cathepsin L样蛋白酶序列,并利用Vector NTI suit 8.0和Tree View软件进行分析。利用SWISS-MODEL网站和SPDBV4.10软件分析Smcathepsin L样蛋白酶的三维空间结构。结果 Smcathepsin L样蛋白酶是一个全长基因,编码336个氨基酸。蛋白由2个典型的cathepsin L样蛋白酶结构域组成,序列当中有信号肽,是一个稳定的可溶性蛋白分子。三维空间立体结构分析结果显示Smcathepsin L样蛋白酶是一个保守的蛋白。Smcathepsin L样蛋白酶编码氨基酸序列与细粒棘球绦虫、链状带绦虫、多房棘球绦虫和人的cathepsin L样蛋白酶基因的同源性分别是50%、50%、49%和46%。分子进化分析显示Smcathepsin L样蛋白酶与日本血吸虫、多房棘球绦虫和链状带绦虫亲源性更近,而与其他物种,例如原虫、线虫和哺乳动物亲源性较远。结论 Smcathepsin L样蛋白酶可能是一个潜在的分泌蛋白,该蛋白能在胞外发挥作用,即在寄生虫的消化、转移、入侵及宿主-寄生虫相互作用中起着重要的作用,是一个具有潜在研究价值的多功能分子。

曼氏裂头蚴糖原磷酸化酶的生物学特性分析及功能域克隆、表达

目的通过生物信息学软件分析曼氏裂头蚴(Sparganum mansoni,Sm)糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)的生物学特性,并对SmGP功能域(fSmGP)进行基因克隆及蛋白原核表达。方法利用生物信息学相关软件,分析Sm GP基因的生物信息学特征。通过PCR扩增得到功能域序列片段,克隆至原核表达载体pET-28α,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达fSmGP,并对表达蛋白进行western blot鉴定。结果Sm GP蛋白由519个氨基酸残基组成,相对分子质量为59.80 kDa,等电点为6.95,由C、H、N、O、S 5种原子组成。SmGP的序列与其他物种的氨基酸序列一致性在70%以上。其氨基酸序列中具有32个磷酸化位点、10个潜在的B细胞表位和15个潜在的T细胞表位。在二级结构中,以α螺旋为主,三维空间结构分析显示以二聚体形式存在,且分子中的功能位点空间分布集中。PCR、双酶切鉴定、测序结果均表明pET-28α-fSmGP的功能区重组质粒构建成功;western blot结果显示成功诱导fSmGP蛋白表达。结论SmGP属于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族,是一个高度保守的蛋白分子,但在蛋白分子的C端是功能区域较为集中和表位集中的区域,表达该功能域为后续对fSmGP免疫学分析等实验提供了指导,同时也为研究曼氏裂头蚴的糖代谢规律奠定了一定基础。

IL-17A基因和IL-17F基因多态性在评估扩张型心肌病发病风险和预后的意义

目的:评估白细胞介素17A(IL-17A)和IL-17F单核苷酸多态性(SNPs)与中国重庆地区汉族人群扩张型心肌病(DCM)发生风险和预后的关系。方法:选取112例DCM患者和125例年龄和性别相匹配的健康人群对照,采用聚和酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性和DNA测序的方法对IL-17A基因rs2275913(G-197A)和IL-17F基因rs763780(7488C/T)两个功能性SNP进行基因分型,然后运用等统计学方法分析SNPs与DCM遗传易感性及预后的关系。结果:IL-17A基因SNP rs2275913(G-197A)携带_(AA)基因型的个体患DMC的风险是携带GG基因型个体的2.124倍(95%CI_(AA)=1.213-3.964,P_(AA)=0.007);在DCM患者中,rs2 275 913位点_(AA)基因型携带者在NYHA心功能分级Ⅳ级、左心室射血分数<35%及有病毒性心肌炎病史的患者中所占比例显著增高(P<0.05);未发现IL-17F基因SNP rs763780(7488C/T)与DCM的发病和预后相关。结论:本研究首次发现IL-17A基因rs2275913(G-197A)位点SNP可能与DCM的遗传易感性和预后相关。

曼氏裂头蚴6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达及转录水平分析

目的分析曼氏迭宫绦虫中6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Sm 6PGDH)的潜在的生物学特征和获得纯化蛋白。方法通过NCBI和ExPASy网站中在线软件,预测Sm 6PGDH基因序列的生物信息学特征。通过PCR技术扩增得到Sm 6PGDH的全长序列和构建pET-28a(+)-Sm 6PGDH重组质粒,利用双酶切和测序手段鉴定重组质粒。利用western blot鉴定重组蛋白和定量PCR分析在不同浓度葡萄糖培养的裂头蚴体内的转录水平。结果Sm 6PGDH蛋白由491个氨基酸组成,理论相对分子质量约为53.84 kDa。该蛋白分子中无信号肽。Sm 6PGDH序列与绦虫、人的同源基因一致性分别为75%和65%以上。Sm 6PGDH氨基酸序列中具有39个磷酸化位点、1个O-糖基化位点和9个B细胞线性表位。通过原核蛋白表达,成功得到可溶性的融合蛋白,并且在不同浓度葡萄糖培养的裂头蚴体内Sm 6PGDH的转录水平升高。结论构建了Sm 6PGDH重组质粒并获得纯化蛋白,为在裂头蚴的糖代谢的规律研究中提供了物质保障。

海南省680例不明原因发热患者恙虫病东方体感染调查

目的了解海南省不明原因发热患者的恙虫病东方体检感染情况,为不明原因发热患者恙虫病防治提供指导。方法收集2018—2021年海南医学院第一附属医院、海南医学院第二附属医院、海口市人民医院和琼中黎族苗族自治县人民医院临床诊断为不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和PCR方法分别对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时收集样本的临床及流行病学信息,并进行流行病学分析。结果共收集临床不明原因发热患者血样680份,恙虫病东方体IgM、IgG抗体和56kD型特异性抗原PCR阳性率分别为23.97%(163/680)、36.62%(249/680)和20.88%(142/680),焦痂或皮疹率为12.06%(82/680)。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为223例,其中男性111例(49.78%),女性109例(48.88%),平均年龄(53.14±15.12)岁,其中40~<60岁98例(占43.95%),感染人群民族中汉族136例(占60.99%),农民93例(41.70%),秋季发病114例(51.12%)。临床表现以非特异性症状与体征为主,36.77%患者出现皮肤特异性溃疡或焦痂。结论海南省是恙虫病的疫源地,流行时间有明显的季节性,预防重点应是秋季的农村地区,临床特征以高热和焦痂或溃疡为主。

海南省琼中黎族苗族自治县2019年恙虫病东方体分子流行病学及遗传进化分析

目的通过分析海南省琼中黎族苗族自治县(简称“琼中”)98例不明原因发热患者的恙虫病流行特点,了解该地区恙虫病东方体菌株流行的情况,为该地区制定恙虫病防治策略和控制措施提供科学依据。方法收集2019年1月1日至2019年12月31日琼中黎族苗族自治县人民医院诊断为疑似恙虫病和不明原因发热患者血液样本,利用胶体金免疫层析法和巢式PCR方法对样本进行恙虫病东方体特异性IgM、IgG抗体和恙虫病东方体56kD型特异性抗原基因检测,同时使用预先设计的样本信息表收集患者的临床表现及流行病学信息。针对巢式PCR检测结果为阳性的样本,进行克隆及Sanger测序。对获得的患者临床信息及检测结果进行流行病学分析,将测序得到的序列进行基因遗传进化分析。结果98例样本中,恙虫病IgM抗体阳性率为24.49%(24/98),恙虫病IgG抗体阳性率为46.94%(46/98),恙虫病PCR阳性率26.53%(26/98),焦痂或皮疹13.27%(13/98)。根据诊断标准,最终诊断为恙虫病的患者为33例。感染人群主要以31~50岁的青壮年为主,职业主要为农民。该地区恙虫病的流行以营根镇、长征镇和红毛镇为主并涉及9个乡镇。流行时间有明细的季节性,以7月和11月为主要高发期。流行的基因型主要为Karp型和Gilliam型。结论琼中为恙虫病的自然疫源地,该地区流行的恙虫病东方体基因型主要为Karp和Gilliam型,具有基因多态性。

IL-17A基因多态性及血浆水平与病毒性心肌炎的相关性研究

目的:探讨白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)rs2275913(G-197A)位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)及血浆水平与重庆汉族人群病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)的关系。方法:收集VMC患者200例,根据病程将患者分为急性期组112例和恢复期组88例,并选择同期200例健康体检的正常人作为对照组,采用聚和酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性(PCR-RFLP)、DNA测序等方法检测全部受试者IL-17A基因rs2275913(G-197A)位点SNP,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组血清IL-17水平。结果:VMC组IL-17A基因rs2275913(G-197A)多态位点AA基因型和A等位基因频率均显著高于对照组(P<0.05),携带AA基因型及携带A等位基因(AA+AG基因型)可增加患VMC的易感性(矫正后ORAA=2.197,95%CIAA=1.208-4.279,PAA=0.003;矫正后ORAA+AG=2.051,95%CIAA+AG=1.134-3.995,PAA+AG=0.009)。VMC组血清IL-17水平明显高于对照组(P<0.05),尤以急性期为著(P<0.05)。不论是VMC组还是对照组,IL-17A基因rs2275913(G-197A)多态位点中含A等位基因(AA+AG)者血清IL-17水平均显著高于非A等位基因(GG)携带者(P<0.01)。结论:IL-17A基因rs2275913位点SNP可能与中国重庆地区汉族人群VMC有关,A等位基因是VMC的易感基因。

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。

海口市居民蚊媒防治知识态度行为现状调查

目的了解海口市居民有关蚊媒防制知识、态度和行为情况,为今后更好地开展有针对性的干预措施提供依据。方法采用统一设计的调查问卷,于2017年7-9月在海口市4个区各随机选择两个调查点,每个调查点随机抽取约150个家庭,每个家庭选一位18岁以上的成人作为调查对象进行答卷。结果本次调查共发放问卷1 020份,回收有效问卷988份,有效问卷回收率为96.9%。居民蚊虫防治知识总知晓率为54.8%,其中城区居民总知晓率为58.9%,郊区居民为50.6%,城区居民知晓率显著高于郊区(P<0.05)。不同人口特征(性别、地区、文化程度、年龄和职业)的居民对蚊媒防治知识的知晓率差异有统计学意义(P<0.05)。81.2%的居民意识到蚊虫叮咬会传播疾病,分别有67.1%、52.7%及31.5%知道登革热、疟疾和寨卡病毒病由蚊虫传播。63.8%知道蚊子有雌雄之分,33.6%知道雌蚊吸血。防治态度方面,51.1%的居民迫切希望政府和社区增加灭蚊次数,86.1%的居民认为非常有必要防蚊灭蚊。结论目前海口市居民的蚊媒防治知识需要进一步提高,卫生防疫部门与地方政府应重视开展蚊媒及其传播疾病的健康教育活动。

曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)的生物信息学分析、克隆及表达

目的利用生物信息学方法分析曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体在大肠埃希菌中进行原核表达并纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析SmLAP基因及其编码蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。通过PCR扩增得到目的基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T1中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白利用GST标签层析柱纯化,采用12%SDS-PAGE分析蛋白纯度。结果曼氏迭宫绦虫LAP基因ORF finder显示核酸序列为1 662bp,编码554个氨基酸,预测在第21个氨基酸的位置出现信号肽。切除信号肽后的核酸序列为1 083bp,编码360个氨基酸,理论分子质量单位为40ku,与人LAP基因序列相似性为38%。将SmLAP和人B细胞抗原表位预测结果比对,相似度极低。构建的原核表达载体pGEX-4T1-SmLAP转化入大肠埃希菌后用IPTG进行诱导表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。通过超声破碎、尿素溶解包涵体、透析、GST层析柱后获得单一组分的重组蛋白。结论构建的原核表达系统能表达SmLAP蛋白。生物信息学分析SmLAP是一个有潜在应用价值的免疫诊断分子,且主要以包涵体形式存在。

曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶的生物信息学分析、基因克隆及蛋白表达

目的通过生物信息学分析预测曼氏迭宫绦虫果糖-1,6-二磷酸酶(SmFBPase)的生物学特性,同时对SmFBPase进行基因克隆及蛋白原核表达。方法通过NCBI网站对SmFBPase基因序列进行开放阅读框分析和核苷酸序列同源性分析。通过ExPASy网站预测SmFBPase的理化性质、结构及表位等特性。构建pET-28α-SmFBPase重组质粒,并转化入~E.coli^BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷对其诱导表达,用Western blot进行鉴定。结果SmFBPase由337个氨基酸组成,无信号肽、无跨膜区,理论相对分子质量约37×10~3,为稳定胞内蛋白。SmFBPase的氨基酸序列与人FBPase的氨基酸序列一致性为61.77%,且进化树中两者亲缘性较远,该蛋白含有13个B细胞表位。PCR、双酶切鉴定及测序分析,证明重组质粒构建成功。Western blot显示重组质粒转化BL21后成功诱导表达SmFBPase蛋白。结论生物信息学分析SmFBPase是一个具有潜在研究价值的药物靶点,原核表达的SmFBPase具有反应原性,为研究其糖代谢规律奠定了基础。

基于illumina测序技术分析小泡巨鼠肠道微生物多样性

为探讨海南岛的小泡巨鼠肠道微生物群落组成及其菌群多样性。2019年12月于海南医学院-香港大学热带传染病联合实验室提取25只海南岛的成年小泡巨鼠(14只雄和11只雌性)粪便样本DNA,基于IonS5TMXL测序平台,利用单端测序(Single-End)的方法,构建小片段文库进行单端测序。通过对测序片段剪切过滤,操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)聚类,利用mothur方法与SSUrRNA数据库对OTUs进行物种注释及丰度分析,并进一步开展α多样性分析(Alpha Diversity)和β多样性分析(Beta Diversity)。结果显示,从25只小泡巨鼠肠道粪便样本中共得到高质量序列1481842条,归属为14个门、85个科、186个属。从门分类水平上,小泡巨鼠的主要核心生物群有厚壁菌门(Firmicutes,46.04%),拟杆菌门(Bacteroidetes,25.34%);随后依次为变形菌门(Proteobacteria,17.09%),柔壁菌门(Tenericutes,7.38%),放线菌门(Actinobacteria,1.67%);这5个门占所有菌门的97.52%。属水平上螺杆菌属(Helicobacter)所占比例最大,为12.44%;其次为乳杆菌属(Lactobacillus,11.39%),梭菌属(Clostridium,6.19%),支原体属(Mycoplasma,4.23%),黄杆菌属(Flavonifractor,3.52%)。综上,高通量测序分析表明海南岛小泡巨鼠肠道菌群结构复杂,菌种多样,具有进一步研究的意义。

曼氏迭宫绦虫异柠檬酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达及其在裂头蚴阶段的转录水平检测分析

目的利用生物信息学方法识别和分析曼氏迭宫绦虫异柠檬酸脱氢酶(SmNAD-IDH)核苷酸序列及生物学特征;克隆该基因并诱导蛋白表达,分析其在裂头蚴阶段的转录水平。方法利用生物信息学在线分析工具对SmNAD-IDH基因的核苷酸序列进行识别,预测分析氨基酸序列的理化性质。分别以曼氏迭宫绦虫裂头蚴cDNA、孕节cDNA和成节cDNA作为模板PCR扩增目的基因,扩增产物与表达载体pET-30a重组后转化至BL21细胞中诱导蛋白表达。利用real time PCR技术分析裂头蚴阶段三羧酸循环中3个关键代谢酶的转录水平。结果BLASTx分析SmNAD-IDH基因全长1095 bp,编码蛋白由356个氨基酸组成。该基因与其他寄生虫同源基因核苷酸序列一致性>70%,与人类同源基因核苷酸序列一致性为51%。该蛋白的理论等电点为6.84,分子质量为40 ku,并且氨基酸序列中无信号肽和跨膜区,为脂溶性稳定的胞内蛋白。SmNAD-IDH在裂头蚴、成节、孕节中均有表达,在裂头蚴阶段三羧酸循环中的关键酶柠檬酸合成酶、酮戊二酸脱氢酶、SmNAD-IDH均有转录,以SmNAD-IDH的转录水平较高。结论成功重组SmNAD-IDH基因并诱导SmNAD-IDH蛋白表达,该蛋白对于曼氏迭宫绦虫,尤其是裂头蚴,是具有潜在研究价值的重要代谢酶。