CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。

荔枝P型ATP酶基因家族鉴定及其在采后贮藏过程中响应拮抗菌N-1的表达模式分析

P型ATP酶是植物体内一种重要的膜转运蛋白,在果实能量代谢和酸代谢中发挥重要作用,并广泛参与植物离子运输、抗逆、细胞信号转导等各项生命活动,然而在荔枝或其他无患子科植物中尚未对P型ATP酶基因家族进行全面分析,本研究基于‘妃子笑’荔枝转录组数据,通过对这些基因进行生理生化分析、生物信息学分析和表达分析,共鉴定了28个P型ATP酶基因家族成员基因,探讨P型ATP酶在荔枝采后贮藏过程中的潜在功能。结构和系统发育分析表明该基因可以分为5个亚家族,同一亚族的基因在基因结构和motif基序方面具有很大的相似性,其蛋白二级结构主要以α-螺旋为主,亚细胞定位预测分析发现LcPAs多定位于线粒体(21/28)。通过转录组分析,在采后贮藏期间,荔枝P型ATP酶家族基因中上调表达的基因明显高于下调表达基因,暗示其可能在荔枝采后品质劣变过程中发挥着积极的抵御作用。使用拮抗菌N-1处理荔枝可以有效抑制其果实采后褐变和病害的发生,结合RT-qPCR结果,发现拮抗菌N-1处理能诱导LcPA1、LcPA7、LcPA8和LcPA19在整个贮藏过程中的上调表达,并维持了较高的ATP酶活性,进一步说明P型ATP酶家族基因在抑制荔枝病变过程中发挥着重要作用。本研究为了解荔枝P型ATP酶基因家族基因的进化和功能分析提供了参考,为深入了解拮抗菌N-1保鲜机理的分子调控机理提供新的证据。

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442~1115个,蛋白质分子量范围49.56~124.44kD,等电点为5.0~9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco_32保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高,IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWIN基因家族的功能及调控甘薯源、库关系机制提供理论指导。

红树植物角果木胚轴化学成分及生物活性研究

目的研究角果木胚轴化学成分及生物活性。方法通过反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、HPLC等方法进行分离纯化,根据理化性质、波谱数据并结合参考文献鉴定化合物结构,并对各化合物进行抗菌活性测定。结果与结论从角果木胚轴95%乙醇提取物中分离得到9个单体化合物,分别鉴定为羽扇豆醇(1)、羽扇豆酮(2)、3-表白桦脂酸(3)、lup-20(29)-en-3-oxo-28-diol(4)、桦木醇(5)、3β-(E)-feruloyllupeol(6)、dioslupecin(7)、ergosta-5,7,22-trien-3-ol(8)、5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol(9)。其中化合物1~3、5、9均有一定的抑菌活性,化合物9对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和植物病原菌胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)抑制性较强,MIC值均为0.025mg/mL。

果实能量代谢与采后品质关系的研究进展

果实采收后,其内部仍进行着能量代谢和其他各种代谢活动。研究表明,能量代谢水平和能量状态与采后果实品质变化、病害发生、胁迫响应等有重要关系,能量代谢主要通过干扰果实呼吸作用、活性氧代谢、激素水平、抗病系统等途径发生作用。本研究从外观品质、内在品质、果实衰老与腐烂、冷害发生、病害应答机制、能量代谢的分子调控等几个方面阐述国内外有关果实能量代谢与品质劣变的关系,以期为基于能量代谢调控的保鲜技术的应用提供理论依据和参考。

木薯铵转运蛋白基因MeAMT1.5的克隆及功能初步分析

铵态氮是植物吸收的主要无机氮源,铵转运蛋白(ammonium transporter,AMT)在其吸收过程中发挥着重要作用。本研究从木薯基因组数据库中进行BLAST搜索获得一个铵转运蛋白基因Me AMT1.5,运用生物信息学技术对其理化性质进行分析,并利用酵母异源表达系统对其功能进行初步研究。结果表明,Me AMT1.5基因编码468个氨基酸,分子式为C_(2348)H_(3502)N_(576)O_(635)S_(14),分子量为50.41 k D,理论等电点为5.32,不稳定指数为28.24,属于稳定蛋白。该蛋白含有11个跨膜区,蛋白质二级结构包含有四种构象,以α-螺旋和无规则卷曲为主。与其他植物的进化关系分析表明Me AMT1.5与巴西橡胶树Hb AMT1.5亲缘关系最近。酵母功能互补试验显示转Me AMT1.5基因酵母在低氮条件下生长好于对照,表明其是一个高亲和性铵转运蛋白。通过对Me AMT1.5的功能初步研究有助于下一步深入研究木薯氮高效利用的机理。

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T.C.Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2411 bp,包括一个2277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var.chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构位点(DGSWYGSWGVCFTYG)和OSCs稳定结构保守位点(QW)。CvCAS基因在种子不同成熟期及植株不同组织部位均有表达,其中种子的表达量最高,且在九月与十月的表达量显著高于其他月份。本研究结果为越南油茶三萜皂苷等活性成分合成研究提供理论依据。

AtCIPK8超表达增强拟南芥耐盐性

AtCIPK8是一种蛋白激酶,通过激活AtSOS1外排Na^(+)活性调节植物对盐胁迫的反应,其突变体对盐胁迫非常敏感。然而,AtCIPK8基因的过表达是否能进一步增强植物的耐盐性还不清楚。本研究通过农杆菌介导的方法将AtCIPK8转入到拟南芥中研究其耐盐性。结果显示,NaCl处理均显著抑制了转基因和野生型(WT)植物种子的萌发,但转基因拟南芥种子在100 mmol/L NaCl处理下的发芽率高于野生型。200 mmol/L NaCl处理下,野生型植株表现出萎蔫、失绿等性状,并且株高、植株鲜重都明显低于转基因植株。与野生型相比,过表达AtCIPK8的转基因植株Na^(+)含量较低,K^(+)含量较高,导致转基因植株在盐胁迫下的K^(+)/Na^(+)比值高于野生型植株。此外,在盐胁迫下,转基因和野生型植株的过氧化程度均有所增加,但在AtCIPK8表达的转基因植株中,NaCl处理诱导的过氧化氢(H_(2)O_(2))和丙二醛(MDA)积累量低于野生型植株。本研究结果表明,AtCIPK8通过调节细胞内离子平衡和活性氧(ROS)稳态来促进转基因植物的生长,提高植物耐盐性。本研究为培育耐盐植物提供一个可能的候选基因。