海南地区溶藻弧菌遗传多样性的RAPD分析

以来源于泰国的菌株TG06003作对照，对采自海南地区的27株溶藻孤菌（Vibrio alginolyticus）环境菌株进行了随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分析，其中6株为毒力菌株，另外22株为非毒力菌株。实验共得到70个多态性条带，多态性比率（PP13）为98．6％。基因多样度的算术平均数和加权平均数分别为0．922和0．4544，Shannon’s信息指数的算术平均数和加权平均数分别为0．1391和0．1713。遗传相似度为0．4429-0．8857，遗传距离为0．1214-0．7520。将溶藻弧菌分为毒力菌株和非毒力菌株两个类群进行分析，结果表明，毒力菌株的遗传多样性丰富，它们的基因多样度和Shannon’s信息指数明显高于非毒力菌株；毒力菌株HN08811、HN08155、HN08809、HN08813明显聚为一类，另外2株毒力菌株分别与非毒力菌株HN08304和HN08803聚为一类，溶藻弧菌毒力菌株存在多种遗传型。

盐度、温度和pH对2株海南地衣芽孢杆菌相对蛋白酶活性的影响

采用脱脂牛奶平板法,测定了不同盐度、温度和pH对2株分离自海南热带海水养殖系统的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Pb-WC09001和Pb-WC09002的相对蛋白酶活性的影响.结果表明:随着盐度的增加,2个菌株的相对蛋白酶活性都趋于减弱,当盐度增加到50时,仅Pb-WC09001还存在一定的酶活性,其相对蛋白酶活性为1.56 U.mL-1,说明Pb-WC09001对高盐度环境的适应性更强.此外,还测定了在18～38℃(以4℃为梯度差)范围内菌株的相对蛋白酶活性,当在与菌体培养相同的温度下测定培养液的酶活时,Pb-WC09001与Pb-WC09002酶活性最高的温度均为34℃;当在30℃测定2个菌株在不同温度下的培养液酶活时,酶活性最高的培养液所对应的培养温度分别为22℃和30℃,说明这2个菌株在相同温度下可产生不同的蛋白酶,同时,Pb-WC09001在低温环境下的相对酶活性强于Pb-WC09002.在30℃、盐度30、菌体终浓度为2×103/mL时,Pb-WC09001在pH 8.0、Pb-WC09002在pH 7.5时的酶活性最高,相对酶活均为2.74U.mL-1,因此,Pb-WC09001对海水环境(pH8.0～8.4)的适应性更强.

臭氧水处理技术在对虾养殖生产中的应用

随着我国对虾养殖规模的不断扩大和精养程度的逐年提升，对虾养殖的自我污染和病害的传播蔓延也日益加剧，严重危及对虾养殖业的健康发展。因此，探索和开发可操作性强、效果显著的养殖水质综合调控技术，通过优化和改善池塘养殖环境，减少对虾养殖废水的排放，提高对虾养殖生产的经济效益和生态效益，对推动我国对虾养殖业的可持续发展具有重要的意义。臭氧是一种强氧化剂，具有极强的氧化能力，能快速分解水中有机物，杀菌力较强。臭氧在水产养殖中的应用，可通过其氧化反应起到灭菌、分解有机物和提高水体溶解氧浓度的作用，

饲料组合投喂对白神仙幼鱼生长和体色的影响比较

投喂管理是鱼类育苗及养殖的关键技术之一,对种苗的存活、生长和后期发育有着重要影响。为提高白神仙鱼幼鱼阶段的投喂管理及体色变化认知,通过微颗粒饲料(M)、微颗粒饲料+卤虫无节幼体混合饲料(MA)、卤虫无节幼体+鱼粉混合饲料(AF)3种不同饲料组合进行投喂管理,对淡水白神仙幼鱼生长过程的存活率、生长性能和体色特征进行比较分析。结果表明:(1)3种不同饲料组合幼鱼存活率均高于82%,MA组显著高于M组和AF组(P <0.05)。(2)M组和MA组体质量、体长、增重率、特定生长率显著高于AF组(P <0.05)。(3)幼鱼体表不同部位的颜色特征值具有一定规律性:明度值(L^(*))方面,其大小顺序为腹部中央>鳃盖后缘>后背部;红度值(a^(*))方面,其大小顺序为鳃盖后缘>腹部中央>后背部;黄度值(b^(*))方面,其大小顺序为后背部>腹部中央>鳃盖后缘。(4)卤虫无节幼体的投喂会影响幼鱼体表的黄度特征值的变化。上述结果表明,在白神仙鱼幼鱼养殖的适当阶段使用卤虫无节幼体,可提高其生长性能和强化体色。

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^(-1)IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni^(2+)亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致病机制研究提供良好的实验材料.

褐点石斑鱼脱鳞病病原菌的分离与鉴定

从海南陵水新村港网箱养殖脱鳞病濒死褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)体内分离到3株优势菌株XC08061、XC08062和XC08063,经回归感染试验确定为致病菌。这3株细菌经生化鉴定以及16S rDNA测序分析,确定均为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。其中,XC08061对体长为12～14 cm褐点石斑鱼的半致死剂量为5.8×102CFU/g鱼体质量。药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的25种抗菌药物中,仅对新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6种抗菌药物敏感。

有机酸在合成培养基中对木醋杆菌合成纤维素的影响

在合成培养基中分别添加0.1%柠檬酸、苹果酸、丁二酸、乳酸、乙酸、丙酮酸,发现只有乳酸、乙酸、丙酮酸能使木醋杆菌在合成培养基中繁殖且产生纤维素。当0.4%丙酮酸加入时,纤维素产量最高,达到2.02g/L;0.3%乳酸加入时,纤维素产量最高,达到2.16g/L;0.4%乙酸加入时,维素产量最高,达到2.80g/L。当0.4%乙酸、0.3%乳酸、0.4%丙酮酸同时加入,纤维素产量可达4.45g/L。

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据6株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的gyrB基因序列设计了1对特异性引物F1和R1,扩增产物大小为303 bp,以此引物对为基础,成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L-1(约为200个细菌/反应)的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法 .该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,它为今后从微生物群落结构复杂的环境中分离地衣芽孢杆菌奠定了良好的基础.

木醋杆菌合成培养基探索

通过逐一删减法对参考合成培养基进行简化,结果显示2%葡萄糖,0.3%Na2HPO4、0.1%NH4Cl、0.1%柠檬酸、0.025%MgSO4适合木醋杆菌HN001,再进一步对该培养基进行优化,实验结果显示3%蔗糖、0.1%乙酸、0.1%乙酸铵(或柠檬酸铵)、0.1%Na2HPO4、0.025%MgSO4为最佳合成培养基组成,而KCl和烟酰胺对纤维素的产生有抑制作用。

养殖水体中亚硝酸盐氮的降解试验

亚硝酸盐氮的含量是衡量养殖水质好坏的重要指标之一。在水产养殖过程中,随着人工配合饵料的投喂以及鱼、虾代谢产物的积累,往往导致氮在养殖水体中大量积累,而不同形态的氮又可通过微生物的作用转化成亚硝酸盐氮。亚硝酸盐主要是通过鱼类呼吸作用从鳃部进入血液,

中药和泰药提取物对褐点石斑鱼的免疫效果

采用酒精萃取法,从8种中药和2种泰药中提取了有效成分,并通过氮蓝四唑(NBT)还原法检测了褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)白细胞产生氧负离子能力的强弱和吞噬活性,开展了以上药物对褐点石斑鱼的免疫效果研究.白细胞氧负离子检测的结果表明:当药物萃取物质量浓度为10 g.L-1时,香菇组(C4)的免疫效果最好;当药物萃取物质量浓度为5 g.L-1时,所有实验组的免疫效果均不明显;当药物萃取物质量浓度为2.5 g.L-1和1.25 g.L-1时,黄芪组(C3)、香菇组(C4)、红参组(C5)和复方1组(C7)的免疫效果最为突出;而当药物萃取物质量浓度为0.625 g.L-1时,黄芪组(C3)、杜仲组(C2)和姜黄组(T1)的免疫效果最为突出.白细胞吞噬活性的检测结果表明:红参组(C5)、香菇组(C4)、黄芪组(C3)及复方1组(C7)这4个试验组的白细胞吞噬活性极显著高于对照组(P<0.01).因此认为:红参、香菇、黄芪及生脉玉屏风散这4种药物的萃取物能明显提高褐点石斑鱼的非特异性免疫力,这为今后开展褐点石斑鱼的新型安全的免疫增加剂的研究奠定了良好基础.

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.

乙醇在合成培养基中对木醋杆菌HN001合成纤维素的影响

合成培养基中添加2.0%乙醇,乙醇被氧化成乙酸,木醋杆菌HN001得到大量增殖,对葡萄糖消耗率,从没有添加乙醇培养基中的42.0%提高到74.5%,纤维生成量达到5.40g/L,比不添加乙醇的培养基中提高了10倍。

和厚朴酚自微乳给药系统制备工艺响应面法优化及质量评价研究

目的优化和厚朴酚自微乳给药系统(HN-SMEDDS)制备工艺,并对其质量进行评价。方法采用拟三元相图法筛选HN-SMEDDS的辅料。在此基础上,以微乳粒径大小为评价指标,应用星点设计-响应面法优化HN-SMEDDS处方。然后采用电导率法对最优处方的HN-SMEDDS进行结构表征,并对其质量进行体外评价。结果优化后HN-SMEDDS配方为聚山梨酯80 71.54%,PEG200 14.62%,花生油10.56%,蓖麻油3.28%;在该配方下,和厚朴酚载药质量浓度为60 mg/mL,用纯水将其稀释3倍以上可形成水包油(O/W)微乳液,其平均粒径为(16.83±0.35) nm,多分散系数(PDI)为0.189±0.021,Zeta电位为(-15.530±0.205) mV。HN-SMEDDS在5~400倍稀释形成的微乳液稳定性良好,分散介质类型对其粒径无显著性影响,在-20℃或在室温条件下贮存15 d仍可稀释形成稳定微乳液。该自微乳可显著延长和厚朴酚在人工胃液中的释放时间和提高其在人工小肠液中的释放度。结论优化的HN-SMEDDS制备工艺简单、微乳粒径小、PDI小、稳定性好、制备成本低、能有效提高和厚朴酚在水中的溶解度和在人工小肠液中的释放度。