波纹唇鱼消化系统的形态解剖与肠道上皮的扫描电镜观察

对波纹唇鱼消化系统的解剖构造进行了研究,并利用扫描电镜对其肠道上皮组织进行观察,结果如下:波纹唇鱼为肉食性无胃鱼类,消化道全长极短,颌齿和咽齿都很发达,肠道极粗,比肠长为0.426;肝脏分三叶,呈枫叶状,胰脏弥散性分布在肝脏组织中,肉眼不易分辨;扫描电镜观察发现小肠前部细胞界限不明显,分泌孔较多,微绒毛密而长短不齐;小肠后部细胞界限也不明显,但分泌孔明显减少,微绒毛比小肠前部更密且很平整;直肠细胞为多角形,分泌孔比小肠少,微绒毛较稀疏,且长短不一。

基于Cyt b基因序列研究6种裸胸鳝属鱼类的进化关系

为探讨中国南海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统发育关系,采用PCR扩增产物克隆到T载体后进行序列测定,获得黄边裸胸鳝(Gymnothorax flavimarginatus)、斑点裸胸鳝(G.meleagris)、波纹裸胸鳝(G.undulatus)、云纹裸胸鳝(G.chilospilus)、匀斑裸胸鳝(G.reevesi)5种裸胸鳝的线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)基因全序列1140bp。结合GenBank中的蠕纹裸胸鳝(G.kidako)Cyt b同源序列进行比较分析,结果表明:(1)1140个位点中共有367个核苷酸位点存在变异(32.2%);(2)序列变异的转换/颠换比值平均为3.223;云纹裸胸鳝和斑点裸胸鳝遗传距离差异最大,为0.226;(3)以花鳗鲡(Anguilla marmorata)为外群,采用NJ法和MP法构建系统发育树,在所分析的6种裸胸鳝属鱼类中,斑点裸胸鳝和波纹裸胸鳝聚为一支,位于系统树的基部位置,其余4种聚为另外一支。蠕纹裸胸鳝样本来源于日本海,其余5种裸胸鳝来源于中国南海,从系统树上来看,它们之间并没有明显的地域差异。

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的（CA）15寡核苷酸探针从波纹唇鱼（Cheilinusundulatus）基因组DNABspl43I酶切位点的400～1000bp片段中筛选CA／GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18．T载体上构建富集微卫星基因组丈库后，通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点，阳性序列比例达到73．33％。其中完美型（perfect）类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中，共有28条r31．82％）微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选，其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析，其中4对引物扩增产物为单态，20对扩增产物呈多态性；20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2～12，平均有效等位基因数为3．5。该波纹唇鱼群体的P／C、Ho，He的平均值分别为0．0782、0．8513、0．5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。

波纹唇鱼mtDNA D-loop序列变异分析

为研究波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)线粒体D-loop序列遗传多样性,作者采用聚合酶链式反应和克隆技术对海波纹唇鱼群体(n=25)的mtDNA D-loop序列进行克隆和测序,获得长度大约为1 400 bp的产物。用ClustalX软件进行排序比较,将结果导入MEGA5.0,结果显示出在这25尾个体中,共检测出66个变异位点,包括0个碱基缺失,4个碱基插入,59转换位点,2颠换位点及1个转换和颠换同时存在的位点。并用MEGA5.0软件构建该群25尾个体的NJ和UPGMA系统树。由DNASP软件计算出该波纹唇鱼群体的多态位点数(S)为62,核苷酸多样性(Pi)为0.00606,平均核苷酸差异数为6.907。结果表明波纹唇鱼群体的mtDNA-loop基因个体差异程度不明显。

方斑东风螺2个养殖群体遗传变异的RAPD分析

运用RAPD技术对方斑东风螺(Babylonia areolata Lamarck)泰国养殖群体和海南养殖群体的遗传多样性进行研究。选取21个10 bp随机引物对方斑东风螺2个群体各20个个体进行RAPD分析,21个引物共检测出222条带。泰国养殖群体的多态位点比例为70.27%,Shannon多样性信息指数为0.1858,Nei’s基因多样性指数为0.249 1,群体内个体间平均遗传相似率为0.7920,平均遗传距离为0.2080;海南养殖群体的多态位点比例为73.87%,Shannon信息指数为0.2044,Nei’s基因多样性指数为0.2615,群体内个体间平均遗传相似率为0.7620,平均遗传距离为0.2380。群体内遗传变异占种内遗传变异的76.81%,群体间遗传变异占23.19%。以上分析表明,方斑东风螺泰国养殖群体和海南养殖群体的遗传多样性水平仍较高,但海南群体的遗传多样性水平比泰国群体要高。

云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测

用磁珠富集法分离云斑尖塘鳢的微卫星序列,由所获得的1032个克隆中筛选出146个阳性克隆,经测序81个含有微卫星序列,52个为完美型,27个为非完美型,2个为复合型,其中43个微卫星序列重复次数在10以上。所获得的云斑尖塘鳢微卫星序列中除探针中使用的CA重复单元和GA重复单元外,还有TAC等其他类型的重复单元。设计合成38对微卫星引物,其中29对引物可稳定扩增出条带,使用这些引物对云斑尖塘鳢48个个体进行检测显示:观测杂合度平均值为0.63,期望杂合度平均值为0.43。29对引物中1对引物表现为单态,7对表现为高度多态,14对表现为中度多态,7对表现为低度多态,多态性较为丰富,说明本研究开发的绝大部分微卫星分子标记较为理想。

方斑东风螺健康养殖技术研究

为了探索方斑东风螺的健康养殖技术，在总面积为6433m^2的水泥池中，共放养壳高0．6～1．8cm的贝苗667．0万粒，针对方斑东风螺养殖中常见的肿吻病、脱壳病等疾病，通过定期药物消毒、强化饵料营养等措施，避免了重大流行病的发生。所有贝苗经6～9个月的养殖，共收获规格为150粒／kg的商品螺38564k，每平方米生产商品螺6．0kg，平均成活率为96．0％，饵料系数为4．1。

基于COⅠ序列的DNA条形码在中国南海裸胸鳝属鱼类中的应用

为探讨中国南海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统发育关系,采用DNA条形码技术测定了6种中国南海裸胸鳝的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因部分序列(504bp)。结合来自GenBank中的分布于日本和3种同样分布于中国南海的裸胸鳝属鱼类的相应同源序列进行比较分析,用邻接法和最大简约法构建分子系统树。结果表明:(1)504个位点中共有187个核苷酸位点存在变异(37.1%);(2)序列变异的转换/颠换比值平均为1.5;(3)细斑裸胸鳝(Gymnothorax fimbriatus)与黑斑裸胸鳝(G.favagineus)之间的同源序列碱基差异只有0.20%,支持二者是同种异名的观点;(4)在NJ树和MP树中,蠕纹裸胸鳝和网纹裸胸鳝聚为一支,位于系统树的基部位置。其余8种聚为另外一支,然后又细分为2个较小的分支。

4种虾虎鱼类精子超微结构的研究与比较

采用扫描电镜和透射电镜分别对云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子的超微结构进行了比较研究。研究结果显示：在扫描电镜下云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢、河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢精子均由头部和尾部（即鞭毛）组成。2种尖塘鳢鱼类精子头部均为圆球形,而2种沙塘鳢精子头部则为前端略方的长椭圆形;在透射电镜下这4种虾虎鱼的精子均由头部、中段（即颈部）和尾部（即鞭毛）3部分组成。头部细胞核前端无顶体,细胞核后端的植入窝均较浅,中段不明显,包括中心粒复合体和袖套。云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢的袖套中含有6-8个呈环形单层排列的线粒体,河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢的袖套中含有2-3个线粒体。这4种虾虎鱼类精子尾部的鞭毛细长,轴丝均为典型的“9＋2”型结构,轴丝外侧具有较发达的侧鳍。

匀斑裸胸鳝消化道粘液细胞的类型与分布

根据AB-PAS染色结果,将粘液细胞分为四个类型:Ⅰ型,AB-PAS染色呈红色,含有PAS阳性的中性粘多糖;Ⅱ型,AB-PAS染色呈蓝色,含有AB阳性的酸性粘多糖;Ⅲ型,AB-PAS染色呈紫红色,主要含有PAS阳性的中性粘多糖,同时含有少量AB阳性的酸性粘多糖;Ⅳ型,AB-PAS染色呈蓝紫色,主要含有AB阳性的酸性粘多糖,同时含有少量PAS阳性的中性粘多糖。在匀斑裸胸鳝消化道不同部位粘液细胞分布密度与类型均有差异。口咽与食道粘液细胞相似,呈圆球型,粘液细胞分布以Ⅳ型为主,Ⅱ型、Ⅲ型次之,Ⅰ型较少。前肠粘液细胞以Ⅲ型为主,Ⅳ型次之。中肠粘液细胞以Ⅳ型为主。后肠以Ⅳ型为主,Ⅲ型次之,Ⅰ型、Ⅱ型较少。

云斑尖塘鳢AFLP分析技术的建立

以云斑尖塘鳢为对象,对其扩增片段长度多态性(AFLP)体系中的连接、预扩增、选择扩增等关键步骤的参数进行了对比实验。结果表明,在采用磷酸化接头,预扩增PCR增加延伸反应及20倍稀释预扩增产物的条件下,可得到清晰稳定的电泳图谱。所筛选的48个引物组合中,14个引物组合的产物带型稳定清晰,分布均匀,扩增片段为50-70条。本研究获得的AFLP优化参数及引物能够运用于云斑尖塘鳢群体遗传分析及分子辅助育种研究。

裸胸鳝属鱼类的研究现状与开发利用

裸胸鳝属(Gymnothorax Bloch,1795)鱼类是我国珊瑚礁鱼类资源的重要组成部分。本文对裸胸鳝属鱼类的种类、形态学特征、生活习性、个体发育、繁殖生物学等一些重要的生物学知识和经济价值等进行阐述,并对今后开展裸胸鳝鱼类的研究与开发利用做了展望,为合理、科学地保护与开发利用裸胸鳝鱼类资源提供参考。

CHRNA7基因荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测烟碱型乙酰胆碱受体(nicotine acetylcholine receptors,nAChRs)α7亚基基因(CHRNA7)的表达,笔者根据人源CHRNA7基因序列设计引物,PCR扩增CHRNA7基因,亚克隆到pMD-18T载体中后,测序鉴定并制备重组质粒,以梯度稀释的重组质粒为模板,进行荧光定量PCR来绘制标准曲线,并进行灵敏度和重复性实验,成功建立了检测CHRNA7基因的荧光定量PCR方法。该方法最低可检测10 1 copies·μL^-1,且重复性良好,在10 4,10 5,10 6 copies·μL^-1时,5次重复的变异系数分别是1.22%,1.90%,2.63%。此外,还对人宫颈癌细胞SiHa和人正常宫颈细胞Ect1/E6E7中α7 nAChR亚基基因表达量进行检测,结果显示,α7 nAChR亚基在SiHa细胞系的表达明显低于其在Ect1/E6E7细胞系中的表达(P=0.015)。

HPLC法测定海鲈鱼鱼油中EPA和DHA的含量

设计建立测定海洋鲈鱼鱼油中EPA (二十碳五烯酸)和DHA (二十二碳六烯酸)含量的方法,并测定尿素包合前后鱼油中EPA和DHA含量变化。采用Agilent色谱柱型号XDB (C_(18)),设置柱温38℃、检测波长220 nm、恒定流速1 mL/min,流动相乙腈-水梯度洗脱。结果表明, EPA甲酯和DHA甲酯的检测线性范围分别为0.059～5.9和0.094～9.4μg (R^2_(EPA)=0.999 6, R^2_(DHA)=0.999 9),检出限分别为0.5和0.9μg/mL。在精密度试验中, EPA甲酯和DHA甲酯的RSD分别为0.29%和0.34%。在加样回收率试验中,分别设计了6个加标浓度做检测, EPA甲酯和DHA甲酯的平均回收率分别为99.29%～99.87%(平均99.52%)和99.59%～101.48%(平均100.22%),平均RSD分别为0.24%和0.83%。尿素包合前,原料鱼油中EPA和DHA的含量分别为1.23%和2.52%;尿素包合后,含量分别为5.66%和12.34%。建立的HPLC法稳定、快捷、重复性好,适用于海鲈鱼下脚料鱼油中EPA和DHA含量测定。尿素包合后EPA和DHA的含量显著增长,达到包合前的4.8倍。

一株小球藻伴生菌的分离与鉴定

为获得与海洋微藻存在同一系统并且能促进海洋微藻生长的菌株,本研究利用平板涂布法从小球藻(Chlorella sp.HN11)培养液中分离得到一株伴生细菌。通过形态观察和16S rDNA序列同源性对比来鉴定该细菌,并筛选适合其生长的培养基,采用分光光度法测定藻菌共生的光合色素含量以及小球藻的细胞密度。结果表明:该小球藻伴生菌株为革兰氏阳性菌,富含类胡萝卜素;该菌株的16S rDNA序列与Microbacterium sp.相似性为99%,表明该菌株属于微杆菌属(Microbacterium);藻-菌(10∶1)共培养7 d后,小球藻细胞密度是对照无菌藻的1.64倍,Chla和Chlb含量分别是对照无菌藻的1.55和1.7倍,类胡萝卜素含量无显著差异。本研究对实验室条件下小球藻与伴生菌株的共生关系进行了初步研究,以期为大规模商业化培养小球藻提供技术参考。