α-芋螺毒素TxIB异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体的拮抗活性研究

目的研究α-芋螺毒素TxIB 3个二硫键异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体(nAChRs)的拮抗活性。方法采用Fmoc固相合成法,分别合成TxIB的3个二硫键异构体。利用非洲爪蟾卵母细胞分别表达大鼠和人类的α6/α3β2β3n AChRs,分别测定3个异构体对它们的拮抗活性。结果成功合成了TxIB的3个二硫键异构体,并通过超高效液相色谱(UPLC)与基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱进行了鉴定,且为正确。α-芋螺毒素TxIB的3个二硫键异构体在UPLC的洗脱出峰时间差异明显,其亲水性顺序分别为球状异构体(globular)>带状异构体(ribbon)>珠子状异构体(bead)。质谱鉴定它们的相对分子质量完全一样,且与理论相对分子质量一致。大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs在非洲爪蟾卵母细胞中获得了有效表达,并用该技术体系测知了TxIB的3个二硫键异构体的拮抗活性。其中,TxIB的球状异构体活性最强,对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs的拮抗活性极其相似,其半抑制浓度(IC_(50))分别为28.2与32.0 nmol·L^(-1)。而带状异构体和珠子状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs几乎没有拮抗活性,其IC_(50)>10μmol·L^(-1)。结论本实验人工合成的TxIB球状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs具有高选择性强拮抗活性,这为后续TxIB新药研发提供了研究基础。

α3(S147T)~*乙酰胆碱受体突变型功能模型的建立

目的构建包含α3亚基的烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)点突变型,优化受体突变的方法,并利用nAChRs的激动剂乙酰胆碱(acetycholine,ACh)对突变型的功能进行研究。方法利用聚合酶链反应(PCR)介导的定点突变技术,设计引物并以大鼠nAChRsα3亚基的基因作为模版,获得α3亚基基因的点突变体,通过体外转录获得α3亚基突变体的cRNA。利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统和双电极电压钳技术,对含有α3亚基点突变的2种受体亚型的表达情况进行检测。同时利用ACh对受体突变型的门控特性进行检测。结果成功建立了α3亚基第147位丝氨酸(serine,Ser,S)的突变体模型,激动剂ACh对野生型α3β2 nAChR和α3β4 nAChR的半数有效浓度(EC_(50))分别为55.33和163.00μmol·L^(-1),对突变型α3(S147T)β2 nAChR、α3(S147T)β4 nAChR的EC50分别为33.10和121.10μmol·L^(-1)。结论将α3亚基第147位Ser突变成苏氨酸(threonine,Thr,T)后,成功建立了2个具有功能型的突变体。α3亚基点突变受体模型的成功建立,可为研究药物与α3*nAChR相互作用的分子机制提供功能模型和研究基础,也可为更多受体突变型的建立提供方法借鉴。