斑褐孔菌子实体化学成分的分离鉴定及生物活性研究

为了研究斑褐孔菌(Fuscoporia punctata)子实体的药效物质基础、化学成分及生物活性,采用各种柱色谱与高效液相色谱相结合的方法进行分离纯化,采用核磁共振和质谱等方法鉴定化合物的结构;采用PNPG法、pNPP法和DPPH法分别测定化合物对α-糖苷酶、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制活性和清除DPPH自由基的活性。研究结果初步明确了海南斑褐孔菌的主要化学成分类型,从斑褐孔菌子实体的乙醇提取物中分离得到12个化合物,分别为inoscavin A(1)、inoscavin C(2)、phellibaumin A(3)、phellibaumin D(4)、inonotusin B(5)、phellifuropyranone A(6)、phelligridin D(7)、原儿茶醛(8)、儿茶酚(9)、没食子酚(10)、对羟基苯甲酸(11)和对羟基苄叉丙酮(12),其中化合物1~7为聚酮类成分,化合物4、5、7抑制PTP1B的IC50值分别为(60.83±2.01)、(56.33±1.57)、(66.89±0.96)μmol/L,化合物2、7抑制α-糖苷酶的IC_(50)值分别为(127.77±0.56)、(122.99±1.39)μmol/L,化合物4、7、2、6清除DPPH自由基的IC50值分别为(6.71±0.69)、(25.79±1.59)、(30.45±1.67)、(32.90±1.59)μmol/L。所有化合物均为首次从斑褐孔菌中分离得到,大部分的聚酮类成分具有PTP1B抑制活性、α-糖苷酶抑制活性和清除DPPH活性,研究结果为海南斑褐孔菌的深度开发利用提供理论依据。

基因编辑MeERF127提高木薯抗旱和耐盐性

干旱、高盐和低温严重损害植物的细胞,抑制其生长,显著降低作物产量。AP2/ERF超家族中的乙烯响应因子(ERF)在植物的生长发育和逆境应答中起关键作用。为了研究MeERF127在木薯响应非生物胁迫中的作用,本研究从木薯中克隆MeERF127基因,对其进行序列比对、亚细胞定位、转录活性分析、表达模式分析,构建MeERF127基因编辑载体获得转基因木薯,对其在干旱、盐和低温胁迫处理后的表型和生理指标进行分析,并且分析胁迫响应基因的表达。结果显示:MeERF127基因CDS全长为711 bp,氨基酸序列的N端和C端分别包含YRG和RAYD元件,第14位和第19位的氨基酸是丙氨酸和天冬氨酸,表明MeERF127属于ERF亚家族;MeERF127蛋白亚细胞定位于细胞核,具有转录因子活性;MeERF127在茎中的表达量最高,在愈伤组织中的表达量最低,在块根形成期(植后80 d)的表达量最高,在干旱和盐胁迫后的表达水平上升,在低温胁迫后略下降;构建基因编辑载体,通过农杆菌侵染木薯愈伤组织,Hi-TOM高通量测序结果表明得到了22个碱基缺失和3个碱基缺失的MeERF127基因编辑株系;在干旱和盐胁迫处理后,基因编辑木薯未萎焉,野生型木薯明显萎焉,基因编辑木薯的SOD、POD活性和Pro含量均显著高于野生型木薯,MDA含量显著低于野生型,基因编辑木薯的叶片颜色更浅,胁迫响应基因SOD和WRKY31在基因编辑木薯中的表达量显著高于野生型;在低温胁迫后,基因编辑木薯和野生型木薯均萎焉,SOD活性、POD活性、MDA含量、叶片颜色和胁迫响应基因在基因编辑木薯与对照差异不显著。以上结果表明,基因编辑MeERF127提高了木薯的抗旱性和耐盐性,但对低温胁迫不响应,推测MeERF127可能调控SOD和WRKY31基因以响应干旱和盐胁迫。本研究结果为揭示MeERF127基因在木薯响应干旱和盐胁迫中的作用提供参考。

木薯MeAHL17基因的克隆及表达分析

AT-hook核定位蛋白(AT-hook nuclear localized proteins,AHLs)是一种小的DNA结合蛋白基序,在植物的生长发育、器官构建、逆境胁迫与激素信号应答等方面发挥重要作用。本研究从华南8号木薯(SC8)中克隆获得MeAHL17基因,利用生物信息学方法对MeAHL17基因进行启动子分析、蛋白理化性质分析、保守功能域的预测和序列比对。结果表明:MeAHL17基因的开放阅读框长度为939 bp,编码一个具有312个氨基酸的蛋白,其理论等电点为6.89,分子式为C_(1420)H_(2215)N_(415)O_(451)S_(11),分子量为32.66938 kDa,带正电荷氨基酸残基总数(Lys+Arg)为23,带负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为24,脂肪系数为57.47,总平均亲水性系数(GRAVY)为-0.491,不稳定系数为58.06;该蛋白不含有信号肽,位于细胞膜内,无跨膜结构,含有5个糖基化位点和45个磷酸化位点,是一个不稳定的亲水性酸性蛋白;MeAHL17蛋白包含AT-hook保守核心序列和PPC结构域的保守核心序列,符合AT-hook家族的典型结构特征。通过亚细胞定位和转录活性分析实验证明MeAHL17是一个定位于细胞核且具有转录活性的转录因子。组织表达模式分析表明,MeAHL17基因主要在体胚、须根和愈伤组织中表达。不同激素处理表明,MeAHL17基因受到乙烯(ACC)、茉莉酸甲酯(JA)和生长素(IAA)等激素的诱导表达,推测其可能参与了乙烯、茉莉酸甲酯和生长素信号途径。非生物胁迫处理表明,MeAHL17基因响应干旱和盐胁迫。本研究初步确定了木薯MeAHL17基因在生长发育、激素信号和逆境胁迫等方面具有重要的作用,为进一步研究其功能提供理论依据和参考。

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis(MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194~343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1~194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。

木薯PEPC基因家族成员鉴定及表达分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4植物光合作用的关键酶,而木薯是C3-C4型植物,MePEPC在栽培种的表达量显著高于野生型,迄今尚未有人对MePEPC进行过系统研究。为了解木薯中MePEPC家族成员的基本信息,本文运用生物信息学方法在木薯全基因组中确认了5个MePEPC基因家族成员,并对MePEPC基因家族进行基本理化性质分析、亚细胞定位预测、进化树分析、染色体定位、二级结构预测、基因结构域及启动子顺式作用元件预测。结果表明,鉴定到5个MePEPC基因家族成员,分布在5条染色体上,其中分布在3号染色体的MePEPC2发生可变剪切,序列提前终止,发生功能缺失。系统进化树表明,MePEPC可分为2个亚家族(植物型和细菌型),同组成员基因结构和功能域相似。MePEPC家族成员启动子区域含有不同数量的光响应元件、激素响应元件及胁迫响应元件,表明MePEPC基因家族成员可能参与不同的生长发育调节过程。表达谱显示,MePEPC1、MePEPC4和MePEPC5具有较高表达,且在不同光照时间、不同发育时期、干旱及ABA胁迫下呈现出不同的表达模式,而MePEPC2和MePEPC3表达量极低,几乎不表达。以上研究为深入研究MePEPC基因家族在木薯中的功能提供了基础数据,为木薯高光效育种提供候选基因。