哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^(-1)IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni^(2+)亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致病机制研究提供良好的实验材料.

卵形鲳鲹MHC Ⅱα及MHC Ⅱβ组织特异性表达分析

为了从蛋白水平和mRNA水平上比较和分析MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况,本研究构建了重组载体p ET32a(+)/M-Ⅱα和p ET32a(+)/M-Ⅱβ来诱导其表达,并制备了多克隆抗体,而且通过qRT-PCR技术分析了MHC Ⅱ类基因在卵形鲳鲹正常组织中的表达.结果显示,本研究成功表达了卵形鲳鲹MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因的融合蛋白,并制备出了效价高和特异性强的多克隆抗体;在利用Western Blot技术分析MHC Ⅱα或MHC Ⅱβ基因在卵形鲳鲹不同组织中对蛋白的表达情况时,均检测到一条大小约70k Da的疑似MHC Ⅱαβ二聚体的单一条带,且该MHC Ⅱαβ二聚体在脾脏、头肾、肠道、鳃中的表达量较高,而在胃、心、脑、肝中的表达量稍低.qRT-PCR的分析结果一致表明,MHC Ⅱ类基因广泛分布在不同组织中,尤其在与免疫相关的组织(脾脏、头肾、肠道、鳃)中,其具有较高表达量.

卵形鲳鲹神经坏死病毒基因组的分析及其特异性检测引物的筛选

从海南发病的卵形鲳鲹中分离到一株病毒,经测序分析,推测该病毒为神经坏死病毒.提取病鱼脑部、眼部总RNA,并用其反转的cDNA为模板,分段克隆出RNA1和RNA2片段,测序后通过拼接获得其基因组,命名为GPNNV(Golden Pompano Nervous Necrosis Virus).系统进化树分析结果表明,GPNNV属于RGNNV基因型.为了获得GPNNV特异性强、灵敏度高的检测引物,本研究基于GPNNV的RNA2保守区设计了9对检测引物,然后通过普通PCR及实时荧光定量PCR技术,筛选出1对最佳引物,可以检测到病毒含量为10copies·μL-1的样本.采用筛选出的引物,在病鱼组织中进行检测,结果表明该引物可以准确检测出感染病毒性神经坏死病毒的样本,具有较高的实际应用价值.以上结果可为卵形鲳鲹神经坏死病毒病的诊断提供有效的方法,对卵形鲳鲹神经坏死病毒病的预防具有重要意义.

不同病原性相关分子模式对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响

为研究不同病原性相关分子模式(PAMP)对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响,本研究分别将脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)与提取的大黄鱼头肾巨噬细胞进行孵育,测定大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、溶菌酶(LZM)活性和免疫相关细胞炎症因子(TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8)的表达情况。结果显示:(1)LPS,PGN,LTA,MDP均能显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性和LZM活性,同时显著降低SOD和CAT两种抗氧化酶的活性;(2)在LPS和LTA刺激下,8种免疫相关细胞炎症因子TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8均呈显著性上调趋势;在PGN和MDP刺激下,除IL8,CXCL9外,其余6种免疫相关细胞炎症因子均显著性上调。结果表明,4种病原相关分子模式LPS,PGN,LTA,MDP均能显著影响大黄鱼头肾巨噬细胞的非特异性免疫应答能力和免疫相关细胞炎症因子的表达。

卵形鲳鲹IgM蛋白的纯化和抗血清的制备

为了获得卵形鲳鲹血清免疫球蛋白(Ig M),笔者首先采用硫酸铵二次盐析法对Ig M进行粗提,然后利用蛋白A亲和层析法进行纯化,并以纯化后的Ig M蛋白为抗原,制备该蛋白的多克隆抗体,最后利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Western blot技术检测所获抗血清的效价及效果。结果表明:用饱和硫酸铵二次盐析法提取的蛋白除了重链和轻链2条电泳带外,杂蛋白较多;利用蛋白A亲和层析法可获得纯度较高的Ig M重链和轻链。用纯化的卵形鲳鲹Ig M免疫小鼠,ELISA方法检测获得的多抗血清效价高达1∶25 600。Western blot结果显示,本实验制备的鼠抗卵形鲳鲹Ig M血清可结合显示出目标条带,说明卵形鲳鲹Ig M多克隆抗血清制备成功,为卵形鲳鲹的后续研究工作奠定了基础。