SD大白鼠骨髓多能间质干细胞QY1细胞系的生物稳定性分析

目的：探索建立Sprague-Dawley大白鼠骨髓间质干细胞（mesenchymat stem cells，MSCs）系体外长期培养的适宜条件及其生物学特性，并分析其稳定性，为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供理想的细胞模型。方法：应用细胞生物学、干细胞组织工程学等方法培养并纯化骨髓MSCs，检测细胞生长的形态、换液时间、生长曲线、倍增时间、贴壁率、染色体、培养条件和反复冻存后复苏对其生物学特性的影响。结果：多次传代后的细胞呈均一的成纤维细胞样；骨髓MSCs原代培养10～12d时融合至80％～90％，不同的首次换液时间之间差异没有统计学意义（P〉0．05）；P1，P3，P10，P20代细胞生长曲线基本相同，细胞的倍增时间P1为34．2h；P3为33．9h；P10为31．8h；P20为30．6h。4代细胞任意两代之间的细胞数差异没有统计学意义（P〉0．05）；传代后细胞迅速贴壁，约89％的细胞贴壁主要发生在接种后10h内。4代细胞任意两代之间的贴壁率差异没有统计学意义（P〉0．05）；在浓度为20％的标准胎牛血清中，骨髓MSCs的增殖活性最高；在种植细胞密度为8×10^4／mL时，骨髓MSCs的增殖活性最高；吉姆萨染色显示P8代骨髓MSCs胞浆为淡紫红色，胞核为深蓝色，细胞内可见1～2个核仁；P8和P20代细胞染色体形态及数目均正常，染色体核型组成均为42，XY，符合大鼠正常二倍体细胞系特征；反复冻存后复苏骨髓MSCs，其活细胞数〉85％。至今已体外培养10个多月。结论：QY1细胞系是纯的、可长期传代的细胞系，可扩增并保持未分化状态，且其生物学性能稳定。

QY1骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测

目的:检测QY1骨髓间质干细胞系在体外向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞分化的能力。方法:选用第5代QY1骨髓间质干细胞系,分别用成脂培养基、成软骨培养基、成骨培养基、5?氮胞苷、血管内皮生长因子、神经细胞培养液(诱导液1为10mmol/Lβ-巯基乙醇;诱导液2为2%二甲基亚砜和10-8mol/L地塞米松)对其进行定向诱导分化。采用染色法、免疫组化法、RT-PCR法鉴定分化后的细胞。结果:在成脂培养基培养21d左右出现大量含脂滴的脂肪细胞,苏丹III染色法检测脂肪细胞胞浆呈桔红色。在成软骨培养基培养21d左右有软骨结节形成,阿尔新蓝染色法将软骨结节染为深蓝色。在成骨培养基培养35d左右有凸出的骨结节形成,VonKossa染色法显示有黑色矿化结节形成。在10μmol/L5?氮胞苷诱导液中能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,免疫组化法显示心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR法检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达。在含有50ng/mL血管内皮生长因子的诱导液中能出现呈直线排列的血管内皮细胞和血管内皮细胞网状结构,免疫组化法显示血管内皮特异性表面抗体CD31和VIII因子表达阳性。神经诱导液1处理组出现神经元,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阴性,神经元特异性核蛋白表达阳性;神经诱导液2处理组出现神经胶质细胞,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阳性,神经元特异性核蛋白表达阴性。结论:本研究证实QY1骨髓间质干细胞系细胞具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞的潜能,提示QY1骨髓间质干细胞系具有向多个胚层、7个方向分化的多向潜能。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离及其诱导定向脂肪细胞分化

目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和鉴定方法,稳定和优化骨髓MSCs在体外定向向脂肪细胞分化的适宜诱导条件。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓MSCs;选用第5代MSCs分别采用CFUf培养法和CFUf集落再克隆生成CFUf集落法鉴定MSCs的增殖和自我更新能力;利用不同组合的成脂培养基定向诱导MSCs分化为脂肪细胞;利用油红O免疫组化染色鉴定分化后的细胞。结果分离和纯化的小鼠骨髓MSCs呈均匀有序的成纤维母细胞样形态;植入2×103～1×105MSC细胞/皿时,可生成不同比例的纯的CFUf集落,且数量与种入的细胞数呈良好的线性关系;小型CFUf集落再克隆生成CFUf集落的能力较弱,而大型CFUf集落具有较高的再克隆生成CFUf集落的能力,再克隆生成CFUf集落率高达90%,而且1个目的集落可再克隆生成多个CFUf集落;不同诱导方案均可诱导MSC生成脂肪细胞,而合用地塞米松(DM)、3异丁基1甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(IS)和消炎痛(ID)时效果最佳,诱导MSC生成脂肪细胞的效率可高达96%以上,且生成的细胞绝大多数为成熟脂肪细胞。结论采取贴壁细胞分离法经过长期传代可得到纯化的小鼠骨髓MSCs,MSCs具有高度增殖、自我更新和定向分化为脂肪细胞的能力;DM、IBMX、IS和ID4种诱导剂合用可诱导96%以上的该细胞定向分化为成熟脂肪细胞。

金纳米微粒DNA芯片检测EGFR基因突变

目的:研制以金纳米微粒标记和银染色信号放大技术为基础的DNA芯片,用于快速检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。方法:氨基修饰的寡核苷酸探针固定于醛基化玻璃片基制备DNA芯片,5′-生物素标记引物用于PCR扩增EGFR基因第18、19、20、21外显子片段,杂交后含互补序列的PCR产物结合于芯片,金纳米微粒借助表面包被的链亲和素识别标记于PCR产物5′-端的生物素而与之结合,再经银染色法放大杂交信号,依据芯片杂交结果判读EGFR基因突变,并用DNA直接测序法进行验证。结果:所制备的DNA芯片可快速检测肿瘤组织标本中EGFR基因突变,检测敏感性达到10-9 mol/L,可检出标本中5%的基因突变。结论:所制备的DNA芯片具有高特异性和敏感性,且操作简便,适用于临床肿瘤组织标本基因突变的快速检测。

纳米金微粒标记技术在基因芯片中的应用

基因芯片是20世纪90年代底兴起的高通量检测新技术,在生命科学研究及临床诊断中具有广泛应用前景。探针标记是其中关键技术之一,影响检测准确性和应用范围。标记材料可包括同位素、荧光素、化学发光物质、酶等,目前较多采用荧光素标记和双波长共聚焦荧光扫描仪检测,除设备昂贵外,

循环microRNAs在乳腺癌诊治中的应用

微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)是一类具有调控功能的小分子非编码核糖核酸,与肿瘤的发生有密切关系。大量研究也充分证实了miRNAs在乳腺癌中的作用。循环miRNAs (circulating miRNAs)指存在于血液或其他体液中的细胞外游离microRNAs,具有稳定性好、取材方便、创伤小,可反复取样检测等优点,且与肿瘤发生和发展相关,因此被认为是最具潜力的肿瘤标志之一。本综述主要总结循环miRNAs在乳腺癌早期诊断、预后预测及指导治疗等方面研究及其临床应用进展,并探讨循环miRNAs临床应用所面临的挑战和需解决的问题。

EGFR基因突变与肿瘤靶向治疗

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）属于受体酪氨酸激酶超家族,在多种恶性肿瘤中表达。配体与EGFR结合诱导形成二聚体和构象变化,活化酪氨酸激酶及信号转导途径,产生细胞增殖、侵润、转移及抗凋亡等效应。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）类靶向药物,如吉非替尼和厄洛替尼等已应用于临床。临床研究显示仅10%~30%患者对TKIs敏感,部分位于EGFR激酶结构域的活化突变与药物敏感性相关。检测EGFR基因突变有助于预测对药物敏感性和提高疗效。随着治疗绝大多数敏感的患者获得继发耐药性,其中约半数有继发突变T790M,降低药物对靶分子的亲和力,其他许多位于EGFR下游信号途径或旁激活途径的分子也参与耐药形成。因此,未来个体化用药和准确预测敏感性,不仅仅要分析EGFR基因,而且要综合考虑下游和其他信号途径的基因,如PI3K,K-RAS,BRAF,MET和PTEN等。