一株猪流行性腹泻病毒的分离培养及其ORF3、sM和N基因的序列分析

研究旨在克隆猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN-HY1902毒株N、sM、ORF3基因并进行序列分析,为PEDV的临床防控提供依据。采用Vero细胞进行病毒分离培养,免疫过氧化酶单层细胞染色法进行病毒鉴定;RT-PCR扩增PEDV HuN1902毒株N、S、sM、ORF3基因,经纯化后进行序列测定,利用DNAStar、Mega等生物信息学软件进行序列分析。RT-PCR扩增得到PEDV ORF3、N、sM片段大小依次为744 bp、1400 bp、和1100 bp。该毒株ORF3基因核苷酸序列与PEDV/USA/Missouri130/2015毒株相似性最高,为99.7%;sM基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018和BJ-2011-1相似性最高毒株,为96.3%;N基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018毒株相似性最高,为98.6%;ORF3、N和sM基因核苷酸序列与疫苗毒株CV777依次为96%、95.1%和93.9%。进化分析显示,该毒株的ORF3、sM和N基因的核苷酸序列与2018年流行毒株CH/SCMY/2018处于同一分支,而与经典毒株CV777、SM98的亲缘关系较远。所分离培养的毒株命名为PEDV HuN-HY1902毒株,为新流行的变异毒株。

1株猪腺病毒3型的分离培养及其fiber蛋白多克隆抗体的制备

本研究旨在对临床1份腹泻病料进行病原的分离培养并探究该病原编码的主要抗原蛋白的生物学特点。采用巢式PCR检测病料猪腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PADV3)核酸并进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定,PCR扩增fiber基因,将其ORF区克隆至pET-28a(+)载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组fiber蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体并测定抗体免疫活性。结果表明,病料为PADV3核酸阳性,感染ST细胞产生典型的“葡萄串”细胞病变效应(CPE),P5~P11代次中的PADV3核酸稳定,分离的毒株P5代为PADV3型血清学阳性,fiber基因开放阅读框(ORF)为1296 bp(GenBank登录号:MT774498),与PADV3毒株的核苷酸相似性最高(86.1%),与其他毒株相似性均低于40%;原核表达的重组fiber蛋白分子质量为45.2 ku,fiber蛋白多克隆抗体与PADV3感染的细胞呈特异性的细胞核染色。本试验成功分离得到1株PADV3毒株,命名为PADV3-HY1812,所制备的fiber蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。