海洋鱼类和甲壳类抗菌肽的研究进展与应用前景

抗菌肽的发现与研究已有几十年的历史,抗菌肽是一类生物体中普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,被科学家誉为"天然抗生素"。海洋动物抗菌肽是鱼、虾、蟹、贝等海洋动物的非特异性免疫防御系统的重要组成部分,在海洋环境中对于防御外源病原菌的入侵起到重要作用。海洋抗菌肽的研发与应用,不仅具有重要的医学开发价值,也是减少抗生素污染、实现海水健康养殖的重要保障。本文主要以鱼类抗菌肽和甲壳类抗菌肽为例,从抗菌肽的来源与分类、结构特点以及生物学活性等方面,简要概述近年来海洋鱼类和甲壳类抗菌肽的一些研究进展及其开发利用前景。

石斑鱼生物学及人工繁育研究进展

石斑鱼(Epinephelidae)是名贵的海产鱼类,主要栖息于热带亚热带近岸岩滩和珊瑚礁水域,是岩礁生态系生物群落的重要类群。本文对国内外石斑鱼类生物学、生态学、渔业资源及人工繁育养殖的研究成果进行梳理,综合报道石斑鱼类的形态比较特征,栖息、摄食和繁殖习性,系统演化与分类,种类地理分布,人工繁育等研究进展以及养殖发展概况;报道全球石斑鱼自然资源明显衰退的现状评估以及对石斑鱼资源保护的共识和相关的渔业管理措施。此外,根据作者多年开展的鱼类遗传生物学研究,指出强化我国海域野生石斑鱼资源保护工作,深入开展杂交石斑鱼的基础生物学研究,加强石斑鱼杂交选育行业管理,是我国石斑鱼渔业产业可持续发展的必要保障。

几种天然产物在海洋防污涂料中的应用研究

将天然产物齐墩果酸、蛇床子素和鱼藤酮作为防污剂,分别制备海洋防污涂料,在厦门海域检验其海区防污效能,并与已报道在厦门海域具防污效能的天然产物喜树碱进行比较,发现蛇床子素和鱼藤酮在海区挂板2个月内显示出一定的防污效能,齐墩果酸没有呈现出防污效能,而喜树碱的海区防污效能明显优于上述3种天然产物。另外,将喜树碱与鱼藤酮进行1∶1复配,并将这2种天然产物与氧化亚铜、N-(2,4,6-三氯苯基)马来酰亚胺(TCPM)和吡啶硫铜锌(ZPT)这3种防污(助)剂分别进行1∶1复配,共获得7种复配防污剂,制备相应的海洋防污涂料以检测其防污效能,发现喜树碱-TCPM、喜树碱-ZPT以及喜树碱-鱼藤酮这3种复配防污剂具良好的防污效能。进一步在上述涂料中选取了防污效能最优的含喜树碱涂料,在福建东山海域和海南陵水海域分别进行了海区挂板试验,结果表明含喜树碱涂料在这2个海域均显示出稳定、优异的防污效能,且期效可达13个月以上。文中研究为推进天然防污产物在海洋防污涂料中的应用进程提供了重要资料。

细基江蓠繁枝变种原生质体制备条件优化

细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var.liui Zhang et Xia)俗称细江蓠(Gracilaria crinale),是我国沿海地区主要养殖的大型海洋经济藻类之一。为获得细基江蓠繁枝变种原生质体制备的最佳酶解条件,本研究以酶解液组分、酶解温度和酶解时间等因素对细基江蓠繁枝变种原生质体分离纯化的实验条件进行优化,最终得出最佳酶解条件为:1)酶解液组分:盐度为25的灭菌天然海水中加入10 mmol/L CaCl_(2)、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.5%果胶酶Y-23、10 U/mL琼脂糖酶,pH 6.3;2)酶解条件:28℃、80 r/min、黑暗酶解8 h。

新型环保海洋防污涂料在航标上的应用研究

本研究以绿色高效天然防污活性物质为防污剂,研制环保型海洋防污涂料AFgreen 500,并通过喷涂工艺涂覆于2个航标浮筒水线以下部位,在福建厦门海域2个区域进行应用评价。6个月的应用效果表明:在水流较低的内湾,该防污涂料相较于目前所用商业防污涂料具有较好的防污效果;水流较大的外海区域,该涂料在浮筒侧面表现出较好的防污效果,但在配重杆部位,一侧区域防污效果较差,另一侧区域具有一定的防污效果。本次应用研究为适用于航标浮筒的环保型防污涂料性能优化提供数据,同时推进了环保型防污涂料在航标浮筒上的应用进程,保障海洋经济绿色可持续发展。

天然产物基防污涂料在水产养殖设施上的应用探索

为探究天然产物基防污涂料在水产养殖设施上的应用效果,以喜树碱(CPT)为防污剂制备了海洋防污涂料,开展了其对水生生物卤虫的毒性检测实验以及在养殖网衣上的海区应用试验。结果表明:含CPT(5%~20%)的防污涂料对卤虫没有显著毒性,且在珠母贝养殖笼具上的防污性能良好,期效达120 d以上,其中含CPT(5%)的涂料对合浦珠母贝生长和存活均没有显著影响;CPT(1%)和溴代吡咯腈(5%)复配的涂料在鱼类养殖网衣上的防污期效大于180 d,且对黄鳍鲷的生长和存活均没有显著影响。本文揭示了天然产物CPT在水产养殖设施的防生物污损方面具应用潜力。

茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种生长的影响

为探究茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)对细基江蓠繁枝变种(Gracilarla tenuistipitata v.liui Zhang et Xia)生长的影响,以细基江蓠繁枝变种外植体为试验材料,设置4种茉莉酸甲酯(MeJA)浓度梯度(0μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1)),添加到盐度为25‰的MES培养液中,研究其对细基江蓠繁枝变种生长的影响。结果表明,低浓度的茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种生长具有促进作用,茉莉酸甲酯(MeJA)添加浓度为20μmol·L^(-1)时,细基江蓠繁枝变种外植体的出芽率和增重率均高于其他处理组。综合各项指标得出盐度为25‰的MES培养液中添加20μmol·L^(-1)MeJA,生长最好,为细基江蓠繁枝变种人工养殖产量的提高提供了一种新的方法。

2种海绵移植块周年生长的观测

为了解决药源海绵的供给问题,促进活性产物的挖掘和筛选,针对福建近海2种海绵:叶片山海绵(Mycale phyllophila)和苔海绵(Tedania sp.)的周年生长率以及生长模式开展了系统研究,旨在为实现药源海绵的规模化移植提供必要的实践依据.采用原位尼龙绳挂养的方式,对随机挑选的各30株海绵,每月进行生长数据的测量,并对海区水温进行周年高密度记录.其中苔海绵的观察时间为2012年7月至2013年8月,叶片山海绵的观察时间为2013年6月至2014年4月.结果表明:叶片山海绵的生长率与水温变化显著相关(p<0.05),在水温较高的6—9月生长迅速,长度增长率达到了(541.47±103.68)%,周长增长率达到了(53.76±87.03)%,其中周长增长率最高达到了229.63%;而随着水温的降低,其生长受到明显抑制,并且过低的水温导致其死亡.苔海绵周年生长较缓慢,周长年生长率仅为(23.37±28.17)%,受海水水温影响不显著(p>0.05),在2013年8月出现最高周长生长率,增长率为93.88%;长度年增长率为(546.45±201.98)%,最大的个体长度增长率出现在8月,达到了956.11%.2种海绵的生长模式相似,均是优先覆盖尼龙绳等附着基的表面,之后才开始向着增加厚度的方向发展.根据实验结果,在海区逐步出现海绵的季节,海绵的移植应该选择在水温开始升高的4—5月,叶片山海绵采用固定在绳索上的移植方式,苔海绵则采用网兜移植的方式,有望获得较理想的移植效果.

拟穴青蟹抗菌肽SCY2在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(>50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。

杂合抗菌肽Scy-Hep3在毕赤酵母中的分泌表达及其抗菌活性

为获得体外稳定表达的高抗菌活性新型抗菌肽,通过重叠延伸PCR技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin (简记为Scy)和斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin 3 (简记为Hep3)的杂合抗菌肽基因scygonadinhepcidin3 (简记为scy-hep3),将scy-hep3与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-scy-hep3,用电转化法将其转化至毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽Scy-Hep3,并进行抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-scy-hep3,用体积分数为0. 5%的甲醇诱导表达24 h,分泌表达上清液中获得了稳定表达的相对分子质量约24 000的表达产物,与预期杂合抗菌肽Scy-Hep3的大小相符;抗菌活性结果表明,杂合抗菌肽Scy-Hep3具有广谱抗菌活性,对被测的3种革兰氏阳性菌(溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和4种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和弗氏志贺氏菌Shigella flexneri)具有较强的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC<12μmol/L);对比于单一的抗菌肽Scy和Hep3,杂合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性显著增强。本研究结果将为杂合抗菌肽Scy-Hep3的生产和开发应用提供数据资料。

拟穴青蟹新型抗菌肽的发现、研究与应用进展

水产养殖业长期过量使用抗生素导致的细菌耐药性增加、水产品中抗生素残留和养殖环境中抗生素污染等问题,已严重影响我国水产养殖业健康发展,因而亟需寻找抗生素的有效替代品.抗菌肽是一类生物体中普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽,因其不同于传统抗生素,具有不易产生耐药性等特性,被科学家誉为“天然抗生素”.海洋无脊椎动物是开发高效且抗多种病原微生物的新型抗菌肽的重要来源.本课题组自2002年起一直聚焦我国水产养殖业抗生素污染的重大科学问题,以研发抗生素的有效替代品为目标,致力于海洋动物新型抗菌肽的研发与利用研究,本综述将重点介绍拟穴青蟹(Scylla paramamosain)新型抗菌肽的发现及其应用进展.

拟穴青蟹两个Crustin新变体的克隆与表达分析

Crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个Crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型Crustins;SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型Crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12h后表达量均极显著上调(p<0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.

荔枝海绵(Tethya sp.)形态及愈伤过程的观察研究

海绵动物具备很强的愈伤再生能力。荔枝海绵是海绵动物中比较特殊的类群,它有皮质层细胞(cortex)和领细胞层细胞(choanoderm)的初步分化。本文对荔枝海绵的形态结构进行观察,并通过切割的方法,有针对性地移除荔枝海绵的特定结构,观察其愈伤过程,以期了解海绵愈伤过程的主要变化及各部分在愈伤过程中的作用。结果发现,愈伤过程发生的主要变化为未受创部分的细胞向受创部分迁移导致的细胞重新排布;其身体结构中的领细胞层和皮质层对其生存愈伤是必要的,而骨针核心对其愈伤影响较小。

潮间带和潮下带养殖的福建牡蛎生长、营养及呈味成分的差异分析

作为一种重要的经济贝类,福建牡蛎(Crassostrea angulata)的养殖模式已从早期的单一潮间带养殖发展到如今的潮间带与潮下带养殖并举.通过测定潮间带与潮下带不同养殖模式下福建牡蛎的生长指标及其一般营养成分、矿物元素、游离氨基酸与呈味核苷酸的含量,比较分析两种养殖模式对牡蛎生长、营养与呈味成分的影响.结果显示:相同养殖周期中,潮下带牡蛎的软体湿质量比潮间带牡蛎的高26.44%,且糖原含量(3.77%)也显著高于潮间带牡蛎(3.15%);所测的10种矿物元素在潮间带牡蛎中的含量均高于潮下带牡蛎,其中Ca、Fe、Mn、Pb含量差异显著;潮间带牡蛎鲜样的味精当量比潮下带牡蛎的高1.49%.综上可见,潮下带养殖模式较利于牡蛎生长和累积糖原,而潮间带养殖模式下牡蛎的矿物元素更丰富且鲜味更佳.

两种方法提取肠浒苔挥发油成分的比较研究

本研究分别采用水蒸气蒸馏法(SD)和溶剂提取法(SE)提取肠浒苔(Ulva intestinalis)的挥发油,通过GC-MS技术对其进行化学成分分析,以峰面积归一法对各成分进行相对定量.结果显示,SD法对肠浒苔挥发油的提取率(0. 038%)低于SE法(0. 800%). SD法所获得的肠浒苔挥发油共鉴定出46种成分,占挥发油总成分的81. 63%,SE法所获得的挥发油共鉴定出30种成分,占挥发油总成分的94. 89%,两者相同成分21种,主要成分均为烃类和醛类物质. SD样品中十五醛的相对含量最高(18. 12%),SE样品中8-十八烷烯的相对含量最高(51. 49%).

两种短指软珊瑚提取物在化妆品开发中的应用潜力初探

以甲醇对2种短指软珊瑚进行提取,检测提取物对各波段紫外线的吸收效果以表征其防晒活性,以酪氨酸酶抑制实验检测其美白活性,并以DPPH法检测其抗氧化活性,首次探讨了软珊瑚来源物质在化妆品开发中的应用潜力。结果表明,在防晒活性方面, Sinularia compacta 和 Sinularia wanannensis 提取物对紫外线具有较强的吸收特性,随浓度增加其光吸收波段也随之扩大,浓度在5.0 mg/cm^3 以上时对280~400 nm波长范围的紫外线均有良好吸收,总体上 S. compacta 提取物的防晒活性略高于 S. wanannensis 提取物,两者对紫外线的吸收效果均优于阳性对照熊果苷和二苯甲酮, S. compacta 提取物在10.0 mg/cm^3 时对紫外线的吸收效果甚至与阳性对照芦丁相当,显示出较高的防紫外效能;在美白活性方面, S. compacta 和 S. wanannensis 提取物均有一定的抑制酪氨酸酶活性作用, S. compacta 和 S. wanannensis 提取物在此活性无显著性差异;在抗氧化活性方面, S. compacta 和 S. wanannensis 提取物均显示出优异的清除自由基能力,且其活性随浓度的升高而升高,在1.0~5.0 mg/cm^3 浓度下 S. compacta 和 S. wanannensis 提取物的抗氧化活性与阳性对照Vc相当,在10.0 mg/cm^3时 S. wanannensis 提取物的抗氧化活性显著高于 S. compacta 提取物和Vc。研究结果为开发软珊瑚源天然新型化妆品物质奠定了重要基础。

农杆菌介导细基江蓠繁枝变种转化体系的建立

为建立细基江蓠繁枝变种遗传转化体系,以细基江蓠繁枝变种类愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导的方法,建立一种细基江蓠繁枝变种遗传转化方法.研究结果发现,往细基江蓠繁枝变种培养液中添加20μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯、2.0 mg·L^(-1)2,4二氯苯氧乙酸、0.5 mg·L^(-1)激动素的植物激素组合,其类愈伤组织诱导效果最好,诱导率高达56.98%.类愈伤组织转化子的GFP绿色荧光检测和PCR鉴定结果均为阳性.这说明细基江蓠繁枝变种外植体的类愈伤组织可作为受体材料,采用农杆菌介导方法可实现外源gfp基因在类愈伤组织中的表达,为江蓠品种的遗传改良提供一个强有力的工具.

大海马不同萃取物的抗肿瘤和抗氧化活性研究

目的 检测新鲜大海马样品的抗肿瘤和抗氧化活性。方法 采用大海马新鲜样品进行冷冻干燥,以75%乙醇提取,并进一步以乙酸乙酯、正丁醇和水对提取物进行不同极性部位组分的萃取,对各萃取物分别开展抗肿瘤和抗氧化活性检测和比较,其中抗肿瘤活性检测采用人胶质瘤细胞LN229,抗氧化活性检测采用DPPH法、ABTS法和FRAP法。结果 大海马乙醇提取物的水相萃取物对人胶质瘤细胞LN229没有灭活作用,但正丁醇相和乙酸乙酯相萃取物均显示出显著的抗肿瘤活性,其中乙酸乙酯相萃取物的抗肿瘤活性较高;大海马的三种萃取物均具抗氧化活性,其中乙酸乙酯相萃取物在DPPH法和FRAP法所得结果中均表现出最高的抗氧化活性,水相萃取物在ABTS法中显示出最高的抗氧化活性。结论 研究结果为海马活性成分尤其是中低极性活性成分在海洋药物和保健品领域的开发提供重要参考。