渤海海域褐潮期微型浮游生物多样性的初步研究

2009年以来每年夏季在河北省渤海海域爆发大面积的褐潮,致使当地海洋生态系统和水产养殖业遭到严重破坏。褐潮优势藻个体微小(约2μm),难以通过传统的形态学观察进行藻种鉴定,因此可借助于分子生物学方法对其进行鉴定。本研究收集了2011年褐潮爆发期山海关、新开口、乐亭海域3个站位的微型浮游生物样品,建立了微型浮游生物的18S rDNA可变区V9的克隆文库并进行测序,BLAST比对确定序列的分类信息。结果表明,各海域浮游生物的多样性组成不同,山海关海域物种丰富度低于新开口和乐亭。同时发现,抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)在3个站位中均具有较高的丰度,占山海关海域测序总量的74%;多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)在3个站位中也均可检测到,在新开口和乐亭海域的丰度较高。以上结果表明,渤海海域的褐潮可能是由这2种褐潮生物共同形成的。

扇贝养殖笼大型污损生物种类组成及分布的挂板研究

2006年9月42007年8月，于青岛流清河湾扇贝养殖笼上进行了周年污损生物的人工挂板实验，共记录大型污损生物65种，优势种有：硬石莼、缘管浒苔、多管藻、太平洋牡蛎、紫贻贝、大室膜孔苔虫、莫氏二段海鞘。主要附着期在5～11月，月板最大湿质量出现在9月，为637．46g／m^2；季板最大湿质量出现在秋季，为3121．28g／m^2；半年板最大湿质量出现在下半年（942月），为5924．57g／m^2；年板湿质量为3551．58g／m^2。从污损生物种类的垂直分布看，表层板以藻类、端足类为主，底层板以双壳类、海鞘等污损动物为主；从全年的物种多样性变化看，夏、秋季物种数多于冬、春季，秋季群落的均匀程度低于其它3季。本文还探讨了下水季节、周期及物种依赖关系对污损生物群落的影响，初步拟出1年周期里污损生物群落的演替过程，认为微生物黏膜形成后，污损生物群落开始步人中期阶段并继续发展，它历经贝类、藻类、端足类、水螅等生物的相继出现与消亡，在年板上形成以紫贻贝为优势的复杂群落，但该群落还未达到最终的稳定阶段。

青岛不同野生群体的单倍体和二倍体龙须菜的AFLP遗传多样性分析与比较

以青岛湛山湾的单倍体和二倍体龙须菜以及青岛台湾路的单倍体和二倍体龙须菜为实验材料,采用AFLP技术,分析了不同地理群体内单倍体和二倍体种群以及不同世代种群间的遗传变异参数。湛山湾单倍体种群的Na(1.169 9)、Ne(1.095 0)、H(0.058 2)、I(0.088 4)与二倍体种群的Na(1.333 3)、Ne(1.227 0)、H(0.129 7)、I(0.190 8),以及台湾路单倍体种群的Na(1.137 3)、Ne(1.089 9)、H(0.050 4)、I(0.074 6)与二倍体种群的Na(1.209 2)、Ne(1.138 6)、H(0.082 5)、I(0.121 9)相比较,可以看出不同世代倍性的龙须菜的遗传多样性是有差别的,同一地理群体的二倍体在遗传变异上高于单倍体;而且湛山湾-台湾路单倍体种群间的Ht(0.058 1)、Gst(0.066 9)、Nm(6.968 3)和二倍体种群间Ht(0.179 9)、Gst(0.327 1)、Nm(1.028 5)的数值也有很大差别,单倍体和二倍体是处于不同分化层次的2个种群,根据Wright对Nm的研究可知,单倍体种群是中度分化的种群,二倍体种群是高度分化的种群。通过分析可知,龙须菜的遗传多样性水平较低,这为育种策略的选择提供了依据。

基于核基因组标记的群体遗传学研究中的数学分析方法

近些年来,各种数学分析方法被广泛的应用于群体遗传学的研究中。然而,对这些数学分析方法的应用缺乏统一的认识,某些研究甚至存在着误用、乱用等现象。对近些年来基于核基因组标记的群体遗传学研究中主要采用的数学分析方法进行了系统的归纳整理,明晰了它们的适用条件和范围。同时,也综述了显性分子标记中对隐性等位基因频率估算的研究进展以及常用的群体遗传学分析软件包含的主要数学分析方法,对合理应用这些参数和软件进行群体遗传学分析具有指导意义。

工程微生物发酵褐藻碳水化合物生产乙醇：生物乙醇开发新方向

生物质（biomass）是生产生物燃油和日用品的天然可再生资源。用生物质生产燃油和日用品有助于解决粮食、环境、能源等重大问题。遗传育种、生物技术、化学加工、工程技术等领域的技术进步和整合，正在逐步使利用生物质生产燃油和日用品成为可能。其中，最具代表意义的是发酵生物质生产乙醇。攀升的油价和保护化石燃料资源的压力，使人们力图用工程微生物发酵生物质生产生物燃油和日用品，遗传工程修饰和改造工业微生物，规模化开发多样生物质。玉米和甘蔗可做工业用，但“食物-燃油”忧虑（concerns）可能终结这一路经。木质纤维素来源丰富，但处理木质纤维素释放单糖，成本高，环境压力大。因此，需要全新思路和策略开发利用非木质纤维素生物质，海洋大型褐藻是新希望。

多物种混合转录组测序(msRNA-seq)及其在海洋生态学研究中的应用

转录组测序是细胞生理学过程和机制的解析手段之一。目前,主要应用在对特定物种或细胞类型在不同生长、发育阶段(时间序列)或不同组织、器官、生长环境(空间序列)中基因转录本丰度的定量和比较上。但是,这并不适用于多物种共存的自然生态系统和多细胞协同作用的生物体中。应运而生的混合多物种转录组分析技术则是可以同时针对两个或两个以上物种或细胞类型的转录组进行分析,以此来解析物种或细胞间的相互作用。其最大特点是靠后期拆分数据而不是通过前期的物理方法来拆分物种或细胞类型。目前,该技术在动物医学领域中使用较多,但在生态系统尤其是海洋生态系统的研究中应用较少。本文介绍了多物种混合转录组测序的概念、方法、研究历程和在海洋生态学研究中的应用及前景,以期为该领域研究者打开新思路,提供新方法。

基于高通量测序分析的荣成扇贝养殖区微型浮游生物群落结构研究

运用Illumina高通量测序技术对2011年7月荣成八河扇贝养殖区和楮岛扇贝养殖区中微型浮游生物群落组成特征进行研究,结果表明,在浮游植物种类组成上,2个样品中共检测到22个纲,其中海金藻、硅藻、绿藻、甲藻和隐藻是主要类群,多形微眼藻和抑食金球藻的18SrDNA相对丰度较高;在浮游动物种类组成上,2个样品中共检测到16个门,在八河扇贝养殖区18SrDNA相对丰度较高的浮游动物是软体动物、有孔虫和纤毛虫,而在楮岛扇贝养殖区则是环节动物的18SrDNA相对丰度较高。结果表明,荣成扇贝养殖区有暴发褐潮的可能,需采取有效措施进行应对。

琼枝白化特征及其附生菌群多样性分析

2021-2022年,海南昌江养殖的琼枝(Betaphycus gelatinae)白化现象频发,造成了一定的经济损失,影响了海洋生态环境。为探究白化琼枝的特征和附生菌群落结构的差异,本研究分析了不同状态琼枝的形态差异;测定了色素含量、光合生理、生理生化等指标;分离、鉴定了不同状态琼枝表面的可培养附生细菌,同时采用16S rRNA高通量测序技术分析了健康琼枝(BgR)和白化琼枝(BgW)表面附生细菌的α多样性、β多样性以及菌群群落结构组成。研究显示,白化琼枝藻体的皮层组织结构遭到破坏,色素含量、最大光合效率(QY_max)显著降低,活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量显著降低(p<0.05);BgW的可培养附生细菌数量(2.76×10^(7) cfu/g)显著高于BgR(3.3×10^(4) cfu/g),BgR中可培养附生细菌优势菌为鲁杰氏菌属(Ruegeria),BgW中为Yoonia属;高通量测序结果显示,两组样品附生菌群的α多样性指数无显著差异,但BgW的Ace、Chao、Simpson指数均有所升高,相似性分析(ANOSIM)表明,BgR和BgW表面附生菌群之间存在显著差异,比对注释结果共识别出253个OTUs,无色杆菌属(Achromobacter)、琼脂小杆菌属(Agaribacterium)、Hirschia属、Mesoflavibacter属和Aquimarina属是BgR和BgW之间相对丰度差异最显著的细菌类群(p<0.001);BgR的优势菌群为无色杆菌属,BgW的优势菌群为琼脂小杆菌属。本研究首次报道了白化琼枝的特征及表面附生菌群的变化,为进一步探究琼枝白化的原因奠定了基础。

虾夷扇贝AMPK基因家族的鉴定及表达

为了解AMPK基因家族在虾夷扇贝中的特征、进化及生物学功能,实验采用比较基因组学及生物信息学的方法对虾夷扇贝AMPK基因家族进行了鉴定、基因与蛋白结构分析、系统发生分析以及时空表达分析,通过虾夷扇贝亚致死温度胁迫实验,研究了AMPK基因家族在高温胁迫时的表达规律。结果显示,虾夷扇贝基因组中共存在3个AMPK家族基因,即PyAMPKα、PyAMPKβ、PyAMPKγ。时空表达分析发现,PyAMPK的3个家族基因在D型幼虫期之前均呈现较高的表达量,其中PyAMPKα基因在受精卵时期表达量最高,PyAMPKβ基因在囊胚时期表达量最高,PyAMPKγ基因在受精卵和2~8细胞时期的表达量达到最高水平。PyAMPK在虾夷扇贝成体器官中呈现不同的表达模式,其中肾脏表达量最高,其次是鳃。受高温胁迫后,肾脏和鳃中的PyAMPK基因短时间内呈现显著的上调表达,并随着时间延长呈现先上升后下降的趋势。研究表明,AMPK基因家族参与了虾夷扇贝早期胚胎发育过程的能量代谢调节以及机体面对高温胁迫的应激调节过程。本研究有助于理解贝类AMPK基因的功能和进化,并为深入阐明贝类应对高温胁迫时的能量调节机制提供理论基础。

多纹钱蝶鱼源海豚链球菌的分离鉴定及灭活疫苗的免疫效果

为探究养殖的多纹钱蝶鱼(Selenotoca multifasciata)病害频发的原因,建立有效的病害防控方法,对暴发于海南养殖场的多纹钱蝶鱼病害开展调查并进行灭活疫苗的研制及免疫保护效果评估。分离到2株病原菌LSSM和DFSM,经形态学和16S rDNA序列分析,将病原鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。将这2株菌与实验室收集保藏的2株鱼源海豚链球菌(菌株GXTO和GXAS)进行了血清型鉴定和耐药性、致病性分析,制备了灭活疫苗并评价了疫苗的免疫保护效果。研究表明:4株海豚链球菌鉴定为血清Ⅰ型。所有菌株均对青霉素类、头孢类、四环素等23种抗生素高度敏感、对丁胺卡那耐药,其中海南株LSSM、DFSM对庆大霉素和卡那霉素抗生素耐药,广西株GXTO和GXAS对庆大霉素和卡那霉素敏感。DFSM、GXTO和LSSM对多纹钱蝶鱼的半数致死量(LD_(50))分别为7.20×10^(2)、2.72×10^(3)和3.40×10^(6) CFU/尾,GXAS未显示毒力。分别制备3株毒株(DFSM、GXTO和LSSM)的灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫多纹钱蝶鱼,各组免疫鱼在同源菌株攻毒后,获得的免疫保护率分别为84.6%~85.7%、69.2%~71.4%和33.3%~40.0%;此外,DFSM免疫鱼在异源毒株LSSM和GXTO攻毒后,获得的交叉免疫保护率分别为86.7%和100%。本研究确定了海豚链球菌是海南养殖的多纹钱蝶鱼病害频发的病原,使用DFSM株制备的海豚链球菌灭活疫苗对多纹钱蝶鱼有良好的免疫保护效果。

3月龄牙鲆形态性状对体质量的通径分析

随机选取3月龄牙鲆Paralichthys olivaceus100尾,分别测量全长(X1)、体长(X2)、头长(X3)、体厚(X4)和体高(X5)共5个形态学指标和体质量(Y)。通过SAS软件进行相关性分析和回归分析,分别计算以形态性状为自变量对体质量的通径系数和决定系数,进而对各性状对体质量的影响进行剖分。明确影响3月龄牙鲆体质量的主要形态性状,为牙鲆选育提供数据支持和理想的测度指标。结果表明,各形态性状间及与体质量的相关系数均达到极显著(P<0.01)。体长、体厚和体高对体质量的通径系数均达到极显著的水平(P<0.01);所选形态性状对体质量的决定系数R2=0.945,表明所选形态性状是影响3月龄牙鲆体质量的主要性状。通过对各形态性状偏回归系数的显著性检验,剔除不显著的性状自变量后,建立最优的多元回归方程:Y=-4.988+0.763X2+2.997X+1.089X,各偏回归系数均达到极显著水平(P<0.01)。

饲料中大豆黄酮对大菱鲆生长、消化酶活力、抗氧化力及肠道结构的影响

为研究大豆黄酮在大菱鲆幼鱼中的营养生理作用,本实验在以鱼粉为主要蛋白源的基础饲料中添加不同剂量的大豆黄酮（0、5、10、20和100 mg/kg）来配制5种等氮等脂的实验饲料,并通过12周的投喂养殖实验评估饲料中不同剂量的大豆黄酮对大菱鲆幼鱼生长性能、消化酶活力、抗氧化力以及肠道结构的影响。结果表明：与对照组相比,饲料中添加不同剂量的大豆黄酮对大菱鲆幼鱼的存活率（98.89%～100.00%）、终末体质量（21.24～24.42 g）、特定生长率（1.81～1.98%/d）、饲料效率（1.01～1.11）、摄食率（1.43～1.51%/d）及形体指标均没有产生显著性影响;饲料中添加大豆黄酮显著降低了大菱鲆幼鱼鱼体的粗蛋白（15.41%～15.59%）和粗脂肪（3.19%～3.93%）含量,但对鱼体的水分（77.41%～79.70%）和灰分（3.46%～3.81%）含量未产生显著性影响;饲料中添加10～100 mg/kg大豆黄酮显著提高了大菱鲆幼鱼的胰蛋白酶活力（35.26～40.66 U/g prot）,但胃蛋白酶（31.75～49.56 U/mg prot）、肠蛋白酶（10.00～14.79U/mg prot）、胃淀粉酶（0.10～0.25 U/mg prot）和肠淀粉酶（0.05～0.17 U/mg prot）的活力在各处理组间没有显著性差异。饲料中添加5、10和20 mg/kg的大豆黄酮显著降低了血清丙二醛（10.67～11.17 nmol/mL）的含量,并显著提高了大菱鲆幼鱼血清超氧化物歧化酶（51.05～53.36U/mL）和谷胱甘肽过氧化物酶（551.40 U/mL）的活力;饲料中添加不同浓度的大豆黄酮对大菱鲆幼鱼后肠肠道结构完整性没有显著性影响,但10～20 mg/kg大豆黄酮显著促进了肠道组织结构的发育和成熟,提高了大菱鲆幼鱼后肠肠绒毛的高度（391.26～401.48μm）。研究表明,大豆黄酮（5～100 mg/kg）对大菱鲆的生长没有显著性的影响,但饲料中适量的大豆黄酮（10～20mg/kg）可以显著提高大菱鲆幼鱼的消化酶活力和抗氧化能力,并促进肠道绒毛的发育。

中国北方沿海6个栉孔扇贝群体的AFLP分析

利用4对AFLP引物首次对我国北方沿海主要的6个栉孔扇贝养殖区的自然采苗群体进行了遗传多样性分析,共扩增得到191条清晰带谱,其中175条具有多态性。对各群体进行遗传多样性分析,结果表明各群体均具有较高的遗传多样性水平,香农式多样性指数在0.347 4～0.391 7之间。AMOVA结果表明遗传变异主要来源于群体内,占总遗传变异的87.22%。个体聚类结果表明,烟台、长岛、大连3个群体的个体聚在一起,可看做1个群体;而荣成群体的个体单独聚在一起,具有独立的遗传结构;胶南和日照的一部分个体聚在一起,其他大部分各群体单独聚在一起;推测是海洋环境和人工养殖影响的共同结果。

牙鲆同质雌核发育二倍体的诱导及其早期生长研究

人工诱导雌核发育是水产动物性别控制的重要技术手段之一,同时也是快速建立近交系或纯系、建立遗传作图群体的方法之一。采用静水压力抑制受精卵第一次卵裂的方法诱导了牙鲆同质雌核发育二倍体。不同的处理起始时刻、不同压力及压力持续的时间对受精卵的发育及染色体加倍率有较大影响。处理组受精卵发育相对缓慢,畸形率较高,正常仔鱼孵化率较低。如果处理前受精卵保持在(15.5±0.5)℃,压力处理受精卵的最佳条件是:从受精后75 min开始、用55 MPa的压力处理6 min,该条件下处理组正常仔鱼孵化率较高,为13.7%,染色体观察和最大核仁数计数结果表明,此时的二倍体诱导率也最高。染色体观察结果还显示在不同处理组中存在不同比例的非整倍体。利用获得的最佳诱导条件处理获得了数千尾雌核发育幼鱼,观察表明,雌核发二倍体鱼的生长速度明显低于普通二倍体,且个体间差异较大。该研究为进一步开展牙鲆全雌育种和连锁图谱的构建提供技术支撑。

单环刺螠对硫化物暴露的呼吸代谢适应

研究硫化物暴露后单环刺组织细胞色素氧化酶(CCO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、延胡索酸还原酶(FRD)等呼吸代谢酶活性的变化,初步探讨了单环刺对硫化物的呼吸代谢适应。将虫体暴露于50,150μmol/L 2个硫化物组和不含硫化物的对照组水体中,分别于暴露后0,2,12,24,48 h和解除暴露后48 h取体壁、呼吸肠等组织进行酶活性分析。结果显示:暴露2 h时,硫化物组CCO活性上升。24 h时,150μmol/L组CCO活性显著低于对照组,到48 h时接近于0,而SDH活性显著低于对照组,FRD活性极显著高于对照组。解除暴露后48 h,虫体的呼吸代谢酶活性与对照组无显著差异。可见,硫化物暴露后,短期内虫体呼吸代谢提高,可能进行硫化物氧化解毒。而随着暴露时间的延长,虫体的呼吸代谢减弱,FRD活性极显著增高,推测体内可能存在将延胡索酸还原成琥珀酸的无氧代谢方式。解除硫化物暴露后,虫体具有较强的自我恢复能力。

单环刺螠生殖腺的发生及雌体的生殖周期

采用组织学方法观察单环刺螠(Urechis unicinctus)生殖腺的发生、卵巢的结构及其年周期变化。结果显示:3.5cm幼螠中,原始生殖细胞迁至后肠管壁外的结缔组织膜处,并数个集群与该处的体细胞共同构成性腺原基;至4cm幼螠,性腺初具雏形;随着个体的生长和成熟,构成卵巢的细胞不断增殖,于虫体尾部后肠腹侧形成长条形膜状的卵巢,外周为卵原细胞,中央为结缔组织,其两端分别与后肠管壁外侧和体壁内侧相连。根据卵巢的组织学和体腔液中雌性生殖细胞的细胞学特征,单环刺螠的卵巢发育可划分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期。单环刺螠生殖腺为低等的定型类型,其卵巢成熟期较生殖期早半个月。

栉孔扇贝17β-hsd4基因的克隆和表达分析

为了研究17β-hsd4基因在无脊椎动物生殖过程中的作用,实验从栉孔扇贝转录组数据库中获得一个表达序列标签,采用cDNA末端快速扩增技术克隆得到1条全长为2 417 bp的cDNA序列,其开放阅读框为2 223 bp,编码740个氨基酸,推测的氨基酸序列含有17β-HSDs特有的4个保守区和17β-HSD4的3个酶结构域,且与人等脊椎动物的序列相似性均在58%以上。半定量RT-PCR显示,该基因在栉孔扇贝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达,其中在肝胰腺和肾脏中表达量明显高于其他组织。对不同发育时期性腺中该基因表达的qRT-PCR检测发现,其在精卵巢发育周期的表达模式不同,且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢。由此推测,栉孔扇贝多种组织中均可以合成17β-HSD4,在精巢的发育和成熟的作用明显高于卵巢。

栉孔扇贝EST-SNP标记开发及多态性分析

EST(表达序列标签)数据库发掘是单核苷酸多态性标记(SNP)开发的重要途径。本研究利用栉孔扇贝转录组测序数据进行SNP筛选,在含有4条EST以上的18 780条contig(拼接序列)中,共获得21 813个候选SNP位点。利用高分辨率熔解曲线结合非标记探针技术,对其中90个位点在4个野生群体中进行了位点多态性检测。得到33个(36.7%)具有二等位基因位点,并对其中26个位点进行了功能注释。进一步的标记验证显示,33个多态位点在青岛野生群体的48个个体中均成功分型,其观测杂合度Ho和期望杂合度He的分布范围分别为0.062 5～0.744 7和0.099 8～0.504 6,其中5个位点偏离Hardy-Weinberg平衡,各位点间没有检测到连锁不平衡。研究为栉孔扇贝群体遗传学和遗传育种分析提供了候选标记。

控制虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

利用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因进行筛查和分析。以虾夷扇贝橘红色闭壳肌和白色闭壳肌cDNA构建正反向差减文库,结合454测序技术在正向差减文库中测序得到2 640条序列,拼接得到50个contigs(重叠群);反向差减文库中测序得到2 496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性比对分析,共获得150多个差异表达基因,从中选择3种清道夫受体SRB1、SRF2和SRCR作为候选基因进行研究,对其在虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素累积和转运的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了初步研究的基础数据。