能量耦合存在于产甲烷菌甲基辅酶M还原酶MCR活化过程

产甲烷菌中甲基辅酶R还原酶(MCR)催化甲烷合成途径中的最后一步,也是甲烷合成途径中速率限制的一步。MCR的活化中心有一必须的辅酶F430。有活性的MCR酶的辅酶F430活性中心的镍处于+1价态。快速有效地活化MCR对于阐明MCR的催化机理和人为控制天然甲烷的合成起到相当重要的作用。然而MCR的活化相当困难,因为辅酶F430的Ni(Ⅰ)的氧化还原电势极低(<-600 m V),很容易被氧化而失活。目前为止,人们还没有找到体外活化MCR的有效方法,但发现H_2和CO可以在体内活化MCR,虽然其活化机理还是一个迷。研究发现,在培养基中添加钨和硒可以提高H_2活化MCR速度8倍和H_2活化MCR的效率约65%;添加fumarate和CH3-SCo M使H_2能够在体外活化MCR(为体内MCR活化程度的30%～40%),让CO体外活化的MCR更稳定。这都说明H_2和CO活化MCR的过程中存在能量耦合反应,正是这种能量耦合反应使得氧化还原电势较高的H_2(-420 m V)和CO(-520 m V)能还原氧化还原电势较低的MCR的活性中心F430(<-600 m V)。

利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a

在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。