果蝇TRP离子通道C端一个新钙调蛋白结合位点的鉴定和分析

瞬时受体电位（TRP）通道是一类钙离子透过性的阳离子通道蛋白家族,参与了视觉、味觉、温度感受等重要的生物学过程。之前的研究表明,钙离子既能够正反馈也能够负反馈地调节瞬时受体电位通道的活性,而这种调节可能是通过钙调蛋白（calmodulin,CaM）与TRP通道的相互作用来进行的。为了阐明这一调控机制,我们首先需要对钙调蛋白与瞬时受体电位通道之间的相互作用进行详细的生化研究。在此项研究中,通过大肠杆菌表达系统,表达和纯化了果蝇瞬时受体电位通道羧基末端不同长短的蛋白片段,并发现了一个新的钙调蛋白结合位点。通过快速蛋白液相色谱、静态光散射以及等温量热滴定技术,鉴定了这一钙调蛋白结合位点与果蝇瞬时受体电位通道之间的相互作用,发现它们在钙离子依赖的条件下,可以形成亲和力非常强的稳定的蛋白复合物（解离常数在0.1~1微摩尔范围）。此外,通过合成多肽的方法,鉴定了果蝇瞬时受体电位通道913~939片段为该钙调蛋白结合位点的核心区域。最后,通过突变实验,进一步明确了果蝇瞬时受体电位通道922位的酪氨酸以及923位的缬氨酸为其钙调蛋白结合位点的关键氨基酸。总而言之,本研究发现和鉴定了果蝇瞬时受体电位通道上一个新的钙依赖的钙调蛋白结合位点,这一发现将为研究瞬时受体电位通道的体内功能提供生化基础,为阐明钙离子通过钙调蛋白调节瞬时受体电位通道的分子机制做出贡献。

牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨定向分化的实验研究

目的:观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨定分化的作用。方法:密度梯度离心联合骨髓贴壁法分离培养新西兰大白兔BMSCs,取P3代细胞随机分成5组(空白组、完全诱导组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组),连续诱导培养21d,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞学检测Ⅱ型胶原蛋白荧光表达,qRT-PCR检测软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达情况,Western Blot检测Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果:牛膝醇提物高、中、低剂量组与空白组相比Ⅱ型胶原蛋白荧光阳性表达明显;牛膝醇提物高、中剂量组与空白组相比软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原明显增加(P<0.05),Western Blot验证Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达明显(P<0.05),其中牛膝醇提物高剂量组效果最佳(P<0.01),与完全诱导组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:牛膝醇提物能够诱导兔BMSCs成软骨分化,其具体作用机制有待进一步研究。