铁皮石斛引种与大棚栽培技术研究

为提升铁皮石斛的产量和质量,阐述了铁皮石斛引种情况,从栽培前准备、移栽、田间管理、病虫害防治等方面总结介绍了铁皮石斛大棚栽培技术。

升流式厌氧氨氧化流化床反应器脱氮效能研究

采用升流式厌氧流化床反应器,研究高浓度厌氧氨氧化工艺的脱氮效能。接种普通好氧活性污泥,以低浓度配水(NH4+-N 60 mg/L,NO2--N 50 mg/L)驯化厌氧氨氧化菌,经150 d富集,填料表面形成红色生物膜,NH4+-N和NO2--N同步去除率高于80%,反应器成功启动;采用低基质进水(NH4+-N 60~300 mg/L,NO2--N 100~355 mg/L),随着进水容积负荷的增加,总氮去除负荷从0.39 kg/(m3·d)提升至1.29 kg/(m3·d);采用高基质进水(NH4+-N 390 mg/L,NO2--N 400 mg/L)时,总氮去除负荷降至1.08 kg/(m3·d),150%回流能有效缓解基质对厌氧氨氧化菌的活性抑制,反应器总氮去除负荷逐渐恢复并升高至1.76 kg/(m3·d),脱氮效能提高63%。

CRISPR/Cas9技术介导猪基因组单碱基编辑效率的研究

利用国际上最新的两种基于CRISPR/Cas9的BE3(Cytosine base editor,CBE)和ABE7.10(Adenine base editor,ABE)单碱基修饰技术对猪基因组靶基因位点进行编辑效率的分析研究。设计、合成并构建4个猪基因组靶基因位点gRNA表达载体,分别与CBE或ABE共转染PK15细胞,继续培养48 h,结合二代测序技术测定单碱基替换效率和indels发生率。结果表明,单碱基编辑系统BE3和ABE7.10对猪基因组靶位点碱基修饰的活性编辑窗口主要分别为5个核苷酸和4个核苷酸;两套单碱基编辑系统主要对编辑窗口内的目标碱基进行单碱基转换而非indel;两套单碱基编辑系统对猪基因组碱基置换有一定偏好性,其中CMAH、MC1R(1-2)、MC1R(2-1)基因编辑窗口内C→T的效率分别为2.2%、0.4%和1.3%;猪GGTA、MSTN-2窗口内A→G的效率分别为1.4%、1.4%。表明单碱基编辑系统BE3和ABE7.10均能够对猪细胞的基因组靶位点序列进行有效的单碱基置换。

基于5993个核基因的被子植物系统发育关系研究

系统发育关系的构建对被子植物分类及进化研究非常重要。长期以来,被子植物系统发育的研究,大多使用质体基因、线粒体基因或少数保守的单拷贝核基因。该研究从已注释基因组或转录组中搜集88种被子植物(包含58目)的核基因集;通过对其进行同源基因聚类及去旁系同源基因,获得了5993个一对一的直系同源基因家族(即对于每个基因家族,每种植物最多一条序列,最少包含50个物种);使用截取各种不同数目基因集的DNA或氨基酸序列,采用串联法(concatenation)和溯祖法(coalescence),共构建了20棵进化树。比较这些进化树,虽然大部分结果支持APG IV中描述的被子植物主要支系之间的关系[(真双子叶植物,单子叶植物),木兰类植物],但真双子叶植物内部各目分支的演化关系与APG IV有一个很大的不同,即认为檀香目和石竹目是蔷薇类植物的姊妹群。基于这些进化树,估算了被子植物各目分支的分化时间,结果表明被子植物的起源时间为237.78百万年前(95%置信区间为202.6~278.08),与主流观点认为的225百万年至240百万年前一致。以上结果为构建进化树提供了一种可行性策略,这种方法允许使用基因数目更多而计算速度更快。

基于RAD高通量测序探讨中国85种杜鹃花属植物的分类

[目的]探讨RAD-seq技术在中国杜鹃花复杂类群分类与物种界定方面的优势。[方法]本研究对杜鹃花属85个种进行了RAD-seq测序,评估了数据的基本特征;同时,以马缨杜鹃基因组作为参考,获得高质量SNP位点,并进一步通过ADMIXTURE、PCA、GCTA及FastTree软件对其进行基因分型、聚类与系统树构建。[结果]本研究中85份材料比对至马缨杜鹃的平均比对率87.52%,在参考基因组上的平均覆盖度为5.21%,最终获得了620371个SNP位点。基于PCA、Structure聚类及系统发育树的分析结果,本研究支持目前在亚属水平(杜鹃亚属、常绿杜鹃亚属、马银花亚属、羊踯躅亚属、映山红亚属和长蕊杜鹃亚属)的形态学分类处理,并突出了鳞片在杜鹃属植物分类中的重要作用。[结论]RAD-seq数据产生的大量SNP位点可区分杜鹃花亚属和组内的大部分物种,说明其在复杂类群分类与物种界定方面具有可行性。

具有潜在改善炎症反应益生菌的筛选

目的:探讨供试菌株对脂多糖(LPS)诱导THP-1细胞分泌炎性细胞因子的调节作用,筛选出具有潜在改善炎症反应的益生菌。方法:通过佛波酯(PMA)诱导THP-1成为成熟巨噬细胞,脂多糖(LPS)刺激成熟巨噬细胞产生炎症反应,评价益生菌对这种炎症反应的改善作用,并对具有改善炎症反应潜力的益生菌株进行胃肠道耐受能力、粘附能力、抑菌能力及抗生素敏感性评价。结果:植物乳杆菌SS-9、SD-H9、鼠李糖乳杆菌SD-L8及罗伊氏乳杆菌WX-94具有改善机体炎症反应的潜力,其中SS-9和SD-H9能显著降低炎症模型细胞IL-1β的分泌(P<0.05),WX-94和SS-9能显著降低炎症模型细胞的IL-6的分泌(P<0.05);同时四株菌均具有较高的胃肠道耐受能力、粘附能力,具有安全通过肠道的潜力;并可以不同程度地抑制致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及阴沟肠杆菌的生长,具有抑制肠道感染的潜力;抗生素敏感性研究表明,四株菌均未发现抗生素耐受的风险。结论:植物乳杆菌SS-9、SD-H9、鼠李糖乳杆菌SD-L8及罗伊氏乳杆菌WX-94均可作为具有潜在炎症调节能力的益生菌进行开发和应用。

CRISPR/Cas9介导人HBB基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入

目的将人地贫相关基因HBB(hHBB)的高频突变体基因型Condons41/42(-CTTT)靶向敲入猪成纤维细胞,并筛选出基因型阳性的纯合子细胞系。方法(1)合成人地贫相关基因HBB(hHBB)突变体,并构建猪HBB位点两条同源臂载体。(2)利用infusion技术将hHBB突变体插入两个同源臂之间,构建同源重组终载体。(3)用在线软件http://crispr.mit.edu/设计靶向猪HBB的sgRNA,并在猪PK15细胞中验证其活性。(4)利用电转染法把CRISPR/Cas9、sgRNA和目的载体共同转入巴马猪胎儿成纤维细胞中,筛选单细胞克隆。结果(1)合成了hHBB突变体,从野生型巴马猪基因组上扩增左同源臂(1.062×103)以及右同源臂(1.024×103),并将三者连接到终载体pGH-LA-hHBB-RA。(2)设计合成了11条靶向猪HBB基因的sgRNA,全部验证活性后最终挑选#2sgRNA和#11sgRNA用于后续实验。(3)通过CRISPR系统共制备出15株有hHBB突变体定点敲入的猪成纤维细胞系,其中6株细胞正常表达hHBB基因。结论本研究所制备的携带人源化HBB基因突变体的猪成纤维细胞,将为创制高度模拟人地贫的模型猪奠定基础。

可降胆固醇的优势乳杆菌筛选

为丰富降胆固醇、降血糖的益生菌资源,以实验室10株潜力益生菌株为实验对象,进行体外降胆固醇能力、胆盐水解酶(BSH)活性及α-葡萄糖苷酶抑制率试验,测定菌株对人工胃液和胆盐的耐受性,评价优势菌株的细胞黏附性能及对抗生素的耐药安全性能。结果表明,植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4对胆固醇的降解率在50%以上,显著高于商业菌株植物乳杆菌299V(p<0.05)。植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌SD-H9对α-葡萄糖苷酶的抑制率高达41.7%、40.1%。植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4、植物乳杆菌10-14、卷曲乳杆菌OF48-2pH5这5株菌具有较好的BSH活力、α-葡萄糖苷酶抑制性、抗逆性以及对HT-29细胞的黏附能力。但仅植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5通过了10种抗生素的安全性试验。综上所述,植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5具有较好的降胆固醇、降血糖潜力,且通过了抗逆性、黏附性、安全性试验,可用于进一步的开发和应用。

利用全基因组重测序技术鉴定五指山猪GHR突变体转基因插入位点

转基因插入位点及其侧翼序列的分子特征对转基因动物新品系培育和生物安全评价至关重要。GHR(growth hormone receptor)显性抑制突变体转基因猪(T274)是本实验室前期制备的一种表型显著的矮小症模型,目前已形成了多世代群体,但该模型中外源突变体的插入位点尚未鉴定。本研究利用BGI-seq500测序平台,对T274转基因猪进行全基因组重测序,获得超过289 Gb的数据(106×)。以转基因载体和猪基因组序列作为参考序列进行比对分析,获得该外源GHR突变体的插入位点,并利用PCR扩增和Sanger测序进行验证。所有的分析数据都支持外源显性抑制突变体插入在五指山猪1号染色体269,513,538~269,514,371之间。序列保守性及功能元件分析表明,该插入位点可能位于转录激活相关的基因间区域。不同世代个体的7种组织中该外源突变体的表达水平和表达一致性都较高,说明该插入位点可以作为一个潜在的转基因“友好位点”。本研究表明全基因组重测序技术可以高效的鉴定转基因插入位点,该插入位点的获得为后期转基因猪新品系的培育奠定了基础,同时也为行业提供了一个可靠的基因组定点整合位点。

响应面法优化乳酸片球菌冻干保护剂配方

添加冻干保护剂能有效提高微生物冻干存活率。为了提高乳酸片球菌冻干存活率,采用Plackett Burman实验设计与最陡爬坡实验结合响应面法,研究了不同冻干保护剂对冻干存活率的影响。结果表明,海藻糖、甘露醇、硫酸锰浓度对菌体存活率影响显著,海藻糖与甘露醇交互作用显著,海藻糖与硫酸锰,甘露醇与硫酸锰交互作用不显著。最佳保护剂配方:海藻糖浓度为73.64 g/L,甘露醇浓度为43.76 g/L,硫酸锰浓度为1.91 g/L,冻干存活率为98.10%±1.03%。实验结果为益生菌生产提供了技术支持。

高产γ-氨基丁酸的双歧杆菌的筛选及对抑郁细胞模型的改善作用

为了筛选出具有缓解抑郁作用的菌株,本研究以94株双歧杆菌为研究对象,以胆盐水解酶活性、抗生素耐性、抗逆性、粘附性作为益生菌评价的基本指标;以高产γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)作为潜在抗抑郁症菌株的筛选指标;最后通过体外抑郁细胞模型试验,研究菌株对抑郁细胞模型的改善作用,进而评价菌株改善抑郁的潜力。结果显示:13株双歧杆菌的胆盐水解酶活性较高,且都不具有种属特异性耐性之外的抗生素耐性。耐酸耐胆盐实验证明:双歧杆菌ZT3、84和95都具有较高的抗逆性能;粘附结果表明:双歧杆菌91、92、95和98具有较强的粘附能力,粘附能力分别为:19.34、33.77、23.23、20.46 CFU/Cell。13株双歧杆菌产GABA能力检测结果显示,双歧杆菌98和95的GABA的产量较高,分别为285.0和232.8 mg/L。抑郁细胞模型试验结果显示:高、中、低剂量高产GABA的双歧杆菌98都具有缓解CORT诱导的细胞损伤的能力,而只有高剂量的双岐杆菌95可以缓解CORT诱导的细胞损伤。由于双歧杆菌98、95具有安全的抗生素耐受范围,较高的酸、胆盐耐受性和粘附能力以及高产GABA和缓解细胞模型损伤的能力,因此,其可以作为潜在的改善抑郁症状的菌株。

接种嗜热侧孢霉对堆肥木质纤维素降解的影响

以猪粪和木屑为堆肥试验材料,研究接种嗜热侧孢霉对堆肥温度、pH、含水量、木质纤维素相对含量、纤维素相关酶活及细菌、真菌群落结构的影响。结果表明,与对照组相比,接菌组升温较快,在堆肥第1天就达到了50℃,达到高温期后含水量下降较快。堆肥结束时,接菌组的纤维素和半纤维素相对含量分别下降了8.50%和16.86%,分别高于对照组的1.50%和13.53%。酶活分析表明,接菌后,β-1,4-葡聚糖酶活性明显提高,木聚糖酶活性出现3个峰值,其中最大峰值为7.90 U/g,是对照组的最大峰值的2.62倍。锰过氧化物酶的活性也有明显提高。接种嗜热侧孢霉在一定程度上也影响了堆肥的细菌及真菌群落结构变化。由此可见,在堆肥中接种嗜热侧孢霉可以加快堆肥升温,促进有机质分解和转化。

四种全基因组测序用文库构建方法的效果比较

探索更适合规模化低深度重测序的建库方式对畜禽基因组育种有重要的应用价值,采用4种不同方法进行文库构建,并比较手工和自动化的低覆盖度数据表现。结果表明,基于MGIcare、PCRfree及TN5等酶切法建库数据与经典机械打断法具有类似的数据表现,并且在操作流程上更加简便、快速。自动化建库较手工方式获得的测序数据一致性更好。利用这些方法可以得到300万~700万的SNPs(对应测序深度0.5×-1×)。

生物育种技术的发展

生物育种技术的应用可突破传统育种技术的限制,培育新品种,促进农业育种的快速发展。本文就生物育种技术的概念进行了具体分析,介绍了当前常见的生物育种技术,并探讨其发展趋势,希望能够为我国生物育种产业提供参考以及借鉴。

生物信息学在动物遗传育种中的运用

随着社会发展和信息技术的进步,生物信息学的研究不断深入,并在多个领域有了广泛的应用,推动了社会的发展。生物信息学在动物遗传育种方面的应用对促进动物的生长发育、促进良种繁殖、促进动物种群稳定等方面具有重要的作用。

分子标记及RAD测序辅助选择改造两系不育系水稻粒型

长粒型稻米具有垩白度低,直链淀粉含量高,蒸煮后坚韧蓬松的优点。为了改良水稻粒型,本研究以‘R15’为长粒型基因供体材料,‘Y58S’光温敏两系不育系作为轮回亲本进行改良,开发出了与控制粒型的qGL7紧密连锁的分子标记R072774。利用该分子标记在每一代选出含有长粒型基因的株系进行建库测序,利用RAD重测序数据进行基因组选择,选择含有长粒型基因且基因组背景最接近轮回亲本‘Y58S’的个体。从F2代开始进行回交,经过4代回交和1代自交,F2代及回交后代与‘Y58S’遗传背景平均相似率为F2(37.07%)<BC1F1(53.03%)<BC2F1(97.89%)。最终得到的新品系系‘深华香15S’总共有356 920 821 bp的片段与轮回亲本‘Y58S’一致,占基因组的95.62%。7号染色体22 482 655～29 697 621 bp区间被‘R15S’替换,使得新品系携带有长粒型基因。与亲本‘Y58S’相比,‘深华香15S’籽粒长度增加29%,长宽比增加了51.7%,成功培育出长粒型水稻不育系。本研究为快速选择、培育长粒型水稻提供了理论和实践参考。

利用MAS技术改良香稻‘R15’的直链淀粉含量

R15是适应性较广,产量较高的中熟晚籼香稻品系,但由于含有Wx^a基因,其直链淀粉含量高达23.5%,严重影响食用口感。因此,我们以含有Wx^b等位基因的不育系Y58S为供体,通过杂交、回交,利用RAD测序技术、分子标记辅助筛选等技术,经过8个世代的筛选,成功用Wx^b基因替换掉R15中的Wx^a基因,培育出1个新的纯合株系——‘深华R16’,其染色体上有10882234 bp长度的碱基,基因型和供体亲本‘Y58S’一致,占2.92%;有362363285 bp长度的DNA片段基因型和受体亲本‘R15’一致,占97.08%;其直链淀粉含量为14%。将‘Y58S’分别与‘深华R16’和‘R15’进行组配,结果表明,‘Y58S’/‘深华R16’组合的直链淀粉含量(13.9%)低于‘Y58S’/‘R15’组合的直链淀粉含量(19.9%),其它米质性状与农艺性状基本一致。本研究为分子标记辅助育种提供了新思路,培育出一新的水稻品系。