ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的三维动态构建

组织工程软骨的体外构建被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的有效途径。为评估载脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)壳聚糖/明胶水凝胶支架,在体外动态构建组织工程软骨相对传统静态培养的优势,本研究用壳聚糖/明胶制备了软骨仿生支架,并检测其物理性质。在制备的水凝胶支架上以1×107cells/m L密度接种ADSCs后,分别置于转瓶及T-瓶的软骨诱导基中培养两周,通过试剂染色、代谢检测和电镜观察,考察了细胞的软骨分化能力、活性、生长分布、渗透深度、增殖及胞外基质分泌情况。结果表明,壳聚糖/明胶支架的平均孔径为118.25±19.51μm,孔隙率为82.60±2.34%,吸水率为361.28±0.47%,弹性模量为61.2±0.16 k Pa,具有良好生物相容性。ADSCs生长状态良好,可向软骨细胞分化,适于作为组织工程软骨构建的种子细胞。表征结果显示,转瓶内水凝胶支架中细胞蛋白多糖的表达更显著,细胞生长分布更加均匀,细胞外基质分泌基本填满整个支架。因此,转瓶载壳聚糖/明胶支架所提供的三维动态环境,是体外构建组织工程软骨的良好方法。

用于ADSCs增殖分化的海藻酸钙/骨粉微胶珠的制备与检测

海藻酸钙微胶珠具有良好的生物相容性、可降解、机械强度高、韧性好等优点,已被广泛应用于组织工程研究。骨粉中含有大量的羟基磷灰石及BMP等生长因子,具有良好的骨诱导活性。结合上述两种材料的优点,制备了一种复合海藻酸钙/骨粉微胶珠,并系统研究了人源脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在其中的最佳包埋密度。通过正交实验综合考虑海藻酸钠溶液浓度、氯化钙溶液浓度和骨粉密度对海藻酸钙/骨粉微胶珠机械强度及传质性能的影响,并采用液滴法制备了最优化的用于ADSCs体外增殖分化的微胶珠。结果表明,海藻酸钠溶液的浓度对微胶珠传质能力和机械强度的影响最大,CaCl2溶液浓度其次,骨粉密度的影响最小。当海藻酸钠溶液浓度、CaCl2溶液浓度和骨粉密度分别为2.5%,4.5%和5.0mg/mL时,微胶珠的性能最好。对细胞扩增倍数的比较和死活染色等检测表明,当ADSCs的初始包埋密度为5×106 cells/mL时,更适于ADSCs的扩增与分化。

诱导多能干细胞对骨关节炎软骨损伤的修复作用

背景:基于干细胞的细胞治疗对于骨关节炎修复有重要的应用前景,其中诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS细胞)具有较强的增殖和分化潜能,且避免了胚胎干细胞的伦理学问题,目前被认为是细胞治疗中最有前景的种子细胞之一。目的:拟探索一种i PS细胞向软骨细胞分化的有效方法,并研究i PS细胞来源软骨细胞对骨关节炎的修复作用。方法:运用三步法将人i PS细胞诱导分化成软骨样细胞,并检测软骨细胞特异性基因和蛋白的表达。然后将分化后的i PS细胞移植到谷氨酸钠碘乙酸诱导的骨关节炎大鼠模型中。移植实验分为4组:对照组注射生理盐水,造模组注射谷氨酸钠碘乙酸,i PS细胞移植组注射谷氨酸钠碘乙酸后移植i PS细胞,分化后i PS细胞移植组注射谷氨酸钠碘乙酸后移植软骨分化后的i PS细胞。移植15周后micro-CT行断层扫描,并对移植后的关节进行组织学分析。结果与结论:(1)与未分化的i PS细胞相比,经过6 d的拟胚体形成和2周的细胞分化,软骨细胞特异性基因和蛋白(Col2A1,GAG和Sox9)的表达量都明显上升;(2)细胞移植15周后,未观察到免疫反应的发生,micro-CT显示移植细胞后软骨下骨的完整性明显得到改善,组织学分析也表明移植细胞后能产生关节软骨基质。i PS细胞来源软骨细胞的修复效果明显好于i PS细胞;(3)结果表明,i PS细胞来源软骨细胞移植可促进骨关节炎大鼠软骨再生,改善关节功能。

整合KGN的壳聚糖-透明质酸水凝胶用于髓核修复的研究

可注射水凝胶在退变髓核组织再生修复中有着重要的意义。研究以磷酸甘油(glycerol phosphate, GP)作为交联剂,利用壳聚糖(chitosan,CS)和透明质酸(hyaluronicacid,HA),制备不同体积比的水凝胶(CS:GP:HA,6:3:1,5:3:2,4:3:3,3:3:4,2:3:5,1:3:6,V:V:V),并整合小分子物质kartogenin(KGN)。检测水凝胶的成胶时间,形态学特征,溶胀度,压缩模量,生物降解度,KGN累积释放量及细胞生物相容性。然后研究KGN,TGF-β及KGN+TGF-β对促进人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,ADSCs)分化为髓核样细胞的影响。结果表明含高浓度HA的水凝胶成胶时间短,溶胀度高,生物降解及KGN释放速率快;其中体积比为5:3:2(CS:GP:HA)的水凝胶更适于脂肪干细胞增殖和分化;免疫荧光及实时定量PCR显示KGN,TGF-β及KGN+TGF-β诱导Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达量与对照组相比具有显著性差异,但各组间差异无统计学意义。研究成功建立可缓释KGN的可注射CS/HA/KGN水凝胶体系,该体系能促进脂肪干细胞增殖并分化为髓核样细胞,为临床椎间盘髓核退变微创手术后髓核再生修复提供一个简单有效的方法。

脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层

背景:越来越多研究表明,组织工程化心肌细胞片层可为心肌梗死后的细胞修复提供一种可靠的治疗方法。目的:以壳聚糖-胶原电纺膜作为支撑膜、脂肪干细胞作为种子细胞,构建"三明治"样多细胞片层。方法:制备壳聚糖与Ⅰ型鼠尾胶原质量比分别为7∶3、5∶5的壳聚糖-胶原电纺生物膜。将第4代脂肪干细胞接种于温敏培养皿培养3 d,分别加入两种壳聚糖-胶原电纺生物膜,20℃培养15 min;待细胞片边缘卷起后,将电纺膜及细胞片层一同移至另一脂肪干细胞生长完全融合的温敏培养皿表面,有细胞层一面朝上,培养30 min后,加入心肌细胞培养基进行培养。培养2周后,多光子显微镜观察细胞状态,免疫细胞化学、Western blot及流式细胞仪检测细胞心肌组织特异性肌钙蛋白Tn I和缝隙连接蛋白Cx43的表达,实时定量PCR仪检测心肌细胞特异性基因表达。结果与结论:(1)细胞状态:7∶3壳聚糖-胶原电纺膜不能为细胞增殖提供足够的空间,5∶5壳聚糖胶原膜能为脂肪干细胞的附着和结构塑形提供更好的支持;7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组死细胞多于5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组;(2)Tn I、Cx43蛋白表达:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞Tn I、Cx43蛋白表达多于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组(P<0.05);(3)心肌细胞特异性基因表达:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞α-sk A、β-MHC、Tn I、Cx43、ANP、GATA-4和Nkx2.5 m RNA表达均高于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组;(4)结果表明:5∶5壳聚糖-胶原电纺膜作为支架有利于脂肪干细胞的增殖与分化,更适宜构建"三明治"样细胞片层。

BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤效果及局部细胞因子表达变化

目的探讨BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的效果及局部细胞因子的变化、作用。方法取SD大鼠采用全骨髓培养法分离培养BMSCs并传代,取第5代细胞采用腺病毒r Ad-EGFP进行转染标记。取12只SD大鼠,随机分为实验组及对照组(n=6)。两组大鼠采用改良Allen撞击装置制备T10脊髓损伤模型后,分别于脊髓损伤处注射10μL 1×106个标记的BMSCs(实验组)及PBS(对照组)。术后观察大鼠一般情况,于术后即刻及1、2、3、4、5周采用BBB评分法进行运动功能评分;术后5周处死大鼠取脊髓样本进行HE染色及神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,Neu N)免疫荧光染色观测,以及细胞因子抗体芯片检测。结果术后5周实验组及对照组各2只大鼠因尿路感染死亡,其余大鼠均存活至实验完成。除术后即刻两组BBB评分比较差异无统计学意义(P>0.05)外,1、2、3、4、5周实验组均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后5周,组织学观察示实验组细胞较对照组多且排列整齐;实验组Nestin、Neu N表达较对照组显著增加、GFAP表达较对照组显著降低,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞因子检测示,两组6个细胞因子表达存在差异;其中,实验组瘦素、睫状神经营养因子高于对照组,粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子、TNF-α、IL-1β与基质金属蛋白酶组织抑制剂1低于对照组。结论 BMSCs移植可促进大鼠脊髓损伤后神经细胞的存活与再生,并调控细胞因子影响脊髓组织功能的恢复。

利用电纺生物膜进行多细胞片层制备的方法研究

目的机体损伤和病变造成的组织缺损通常可以组织工程的方式来进行修复。方法本研究结合细胞片层技术和静电纺丝技术,利用脂肪干细胞制备多细胞片层，并对各种电纺生物膜结构形貌、亲水性能、力学性能、以及与脂肪干细胞相容性等进行较为深入的比较研究。结果表明制备的仿细胞外基质（ECM）结构的多孔网状电纺生物膜在形态上模拟ECM，而且具有孔隙率高,贯通性好,比表面积高,利于细胞的生长和粘附的特点。结论本研究利用电纺生物膜作为支撑膜，增加了细胞的增殖空间和营养物质的流通，又保证了细胞片层在转移过程中的完整性，从而给临床多细胞片层移植治疗提供了一个简便易行的操作方法。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的神经分化研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)对移植脊髓损伤(SCI)模型神经再生修复的作用及其机制。方法 (1)分离原代SD大鼠BMSC;(2)体外诱导BMSC向神经分化,应用免疫荧光技术检测神经诱导分化后的BMSC神经标志Nestin、Neu N的表达;(3)运用改良的Allen撞击装置制备SD大鼠SCI模型,成年雌性SD大鼠12只,随机分组:损伤对照(n=6),BMSC细胞移植组(n=6),并选择在SCI后半小时内在蛛网膜下腔原位移植1×106 BMSC细胞注射治疗,对照组原位注射10μl PBS作为对照。每周对SCI大鼠进行BBB运动功能行为学评价。(4)在治疗后1个月处死SCI大鼠取脊髓样本进行冰冻切片检测Nestin、NeuN神经标记物表达情况,从而评判BMSC对SCI的治疗效果。计量资料结果服从正态分布、方差齐性时,采用t检验;若不服正态分布,采用KruskalWallis H秩和检验。结果 (1)分离的BMSC纯度高、生物学特征稳定。(2)BMSC在体外神经诱导环境下可分化为神经细胞,对比正常对照组,神经诱导组Nestin与Neu N的表达具有统计学差异(t=11.49、6.76,P<0.05)。(3)BMSC移植治疗SCI大鼠运动行为学功能显著改善,移植组比对照组治疗5周后的BBB评分具有统计学意义(t=5.59,P<0.05);损伤导致组织形态学出现脊髓白质灰质结构性损毁,神经细胞大量丢失,而BMSC移植组Nestin、GFAP与Neu N表达细胞均较损伤组差异有统计学意义(t=4.74、6.59、15.46,均P<0.05)。结论 BMSC移植可促进SCI后神经细胞的存活与再生分化,在一定程度上促进SCI脊髓组织功能的恢复。