CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

油酸脱氢酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶,它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明,AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因,决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。本研究根据AhFAD2基因序列,设计了相应sgRNA序列,并构建了旨在敲除FAD2A和FAD2B两个花生油酸脱氢酶的CRISPR/Cas9基因编辑载体。经花生基因转化后,通过对转基因花生突变位点基因组序列分析找出基因突变体。对靶基因分析发现,16株转基因花生含有29个FAD2A基因突变,其中16个突变引起蛋白质序列变化;11株转基因花生含有30个FAD2B基因突变,其中17个突变引起蛋白质序列变化。FAD2A和FAD2B蛋白质序列的变化可影响花生油酸脱氢酶的活性,改变油酸催化脱氢,使亚油酸合成受阻,油酸含量增加。本研究为研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育种提供了宝贵的基因突变体材料。

红树林沉积物中多环芳烃降解菌Aquabacter sediminis P-9T的分离、鉴定及降解机制的研究

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类具有致畸、致癌和致突变特性的高风险有毒污染物,近年来,关于红树林生态系统受到PAHs污染的报道引起广泛关注,微生物降解被认为是处理PAHs污染的有效、经济和多功能替代方法。目前,研究者发现了大量细菌利用PAHs污染作为碳源和能源,然而其普遍存在降解效率偏低、降解谱系窄、对高盐环境适应性差等问题,红树林来源的PAHs降解菌的降解机理尚待充分挖掘。【目的】在红树林沉积物中定向筛选针对PAHs的高效广谱降解菌,并深入探讨其降解效能与作用机制,以期为红树林生态系统中微生物污染修复技术的创新研发提供坚实的科学基础。【方法】从深圳福田红树林沉积物筛选出一株降解PAHs的潜在新种菌株P-9T,通过形态学观察、生理生化特性检测和16S rRNA基因序列分析,对该菌株进行鉴定;基于菌株基因组测序与分析预测该菌株的PAHs代谢潜能;在不同温度(25−40℃)、不同pH(5.0−9.0)和不同底物条件下,对菌株P-9T的降解能力进行测定;利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)技术检测菌株降解PAHs的中间代谢产物,初步揭示P-9T降解PAHs的代谢机制。【结果】菌株P-9T为黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)水杆菌属(Aquabacter)的潜在新种,暂命名为Aquabacter sediminis P-9T,也是Aquabacter属中首次发现的PAHs降解菌种;在菌株A.sediminis P-9T的基因组中则发现了一条完整的苯甲酸盐降解通路,以及参与萘和其他PAHs降解的脱氢酶、水杨酸羟化酶和细胞色素P450等关键基因。菌株P-9T可以在25−40℃和pH 5.0−8.0的条件下降解菲,并且可分别以萘、菲、芘为唯一碳源生长繁殖。在菲初始浓度为50 mg/L下培养5 d降解率达100%。利用HPLC-ESI-MS/MS技术检测发现,该菌株对萘、菲、芘降解的中间代谢产物包括1-羟基-2-萘甲酸、1,2-萘二酚和儿茶酚和1-羟基-2-萘醛。推断菌株P-9T是采用水杨酸途径降解PAHs。【结论】A.sediminis P-9T是Aquabacter属的新种,而且是该属中首次发现的PAHs降解菌,最佳降解条件为37℃和pH 7.0,可通过水杨酸途径高效降解萘、菲及芘。

基于深圳男男同性性行为人群的HIV-1广谱中和抗体筛选分析

目的:筛选基于深圳本地男男同性性行为者(Men who have sex with men,MSM)人群队列中HIV-1流行毒株的广谱中和抗体(Broadly neutralizing antibodies,bn Abs),为下一步机制和应用研究奠定基础。方法:建立小型MSM队列,按计划分别定期随访、留样,测序分析人群中HIV-1病毒流行亚型。选取将骨架质粒与系列标准HIV-1 env质粒12款,分别共转染293细胞制备单次感染能力假病毒。建立TZM-bl细胞实验测定并计算中和活性(ID50Titers)技术平台,用于选定病毒亚型样品的筛选。最后取所获具有一定广谱中和抗性的代表性血样,通过抗体竞争实验初步分析其结合位点。结果:近年来,深圳MSM的HIV-1流行亚型分布中,CRF07_BC(43.4%)和CRF55_01B(15.4%)占比快速增长。选择来自该人群队列CRF07_BC感染者34人88份血样进行广谱中和抗性检测,筛选出具有一定广谱中和抗性的血样10份(ID50 Titer≧25),其中2例显示了较佳中和宽度,可作用于全部12种假病毒中的7种(58.3%)。初步分析其结合机制均非靶向gp120。结论:本研究成功建立小型MSM队列和TZM-bl检测分析技术并应用于实践,初步筛选结果提示部分具有中和活性的患者血清内存在bn Abs。