荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势,如:实现对活细胞的实时“可视化”研究,同时具有高时空分辨率;检测更加灵敏、结果可信度高;且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。介绍FRET-FLIM技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了FRET-FLIM技术的未来发展趋势,以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解。

拟南芥AGO基因家族分析及盐胁迫下的表达验证

argonaute(AGO)蛋白家族成员在小核糖核酸(RNA)介导的转录后调控中有重要作用.通过拟南芥AGO蛋白家族的结构域及各类植物中的AGO蛋白的进化关系进行分析,发现AGO蛋白在植物中结构和进化相对保守.根据已有的芯片数据,对拟南芥中AGO蛋白家族的组织表达进行分析,发现某些AGO基因具有组织表达的特异性.进一步通过基因上游启动子响应元件分析,以及盐等胁迫下的芯片和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验数据分析,发现AGO2、AGO3和AGO7等基因受到盐等非生物胁迫的诱导表达.初步探明了拟南芥中AGO基因家族在盐胁迫下的差异表达规律.

水稻microRNA及其靶基因的系统鉴定

microRNA(miRNA)在植物生长发育和环境胁迫中发挥着重要的作用.本研究基于49个水稻小RNA测序数据,系统分析了已知miRNA的表达,并鉴定到了新的水稻miRNA.研究发现,miRBase上注释的水稻miRNA中,只有39%具有可检测的表达.此外,对水稻降解组数据的分析鉴定到一些新的miRNA靶基因,包括2个新的miR444靶基因,它们分别编码WD40蛋白和热休克因子型DNA结合蛋白.

CRISPR-Cas9介导靶向突变拟南芥ERF 1-1基因

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对拟南芥真核生物释放因子1-1(eukaryotic release factor 1-1,ERF 1-1)基因进行高效率的靶向突变以获得该基因突变体,观察突变体表型并进一步探索ERF1-1基因在拟南芥中生长发育中的功能.根据原间隔序列邻近模块序列(protospacer adjacent motif,PAM)的特异性,选择1对位于ERF1-1基因内部的靶点序列,并设计1对向导核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA),将与这对gRNA序列碱基互补配对的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)序列构建到pHEE401载体中.将构建好的重组质粒转化到农杆菌GV3101菌株,接着利用含有重组质粒的农杆菌对拟南芥花序进行滴花法侵染.用含有潮霉素的培养平板筛选转基因T1代阳性苗并传代培养,通过测序检测每一代植株靶点附近是否发生编辑.采用目前最有效的CRISPR/Cas9基因靶向编辑技术突变拟南芥ERF1-1基因,成功获得了一系列不同形式的ERF1-1基因突变植株,在正常生长条件下ERF1-1突变植株与野生型相比具有轻微的生长发育缺陷表型.根据erf1-1突变植株的表型推测ERF1基因家族的成员ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3可能在功能上冗余.研究成果可为后续拟南芥ERF1基因功能研究提供遗传学方面的数据.

一种植物基因组DNA快速提取方法的建立与评估

植物基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的提取是植物分子实验的基础,但随着样本数量的增加,基因组DNA的提取成为植株基因型鉴定以及单核苷酸多态性检测等分子实验的限速环节.为解决现有技术中提取植物基因组DNA过程繁琐、耗时耗力的问题,从提取液配方和提取条件等方面改良常规快速植物基因组DNA提取法,缩短了样本制备时间并简化了提取步骤,改良后每个样本DNA制备需时不到90 s,同时采用96孔板和配套设施显著提高了实验通量.该方法对植物样本的状态要求低、扩增效率高、成本低,适用于拟南芥、水稻和玉米等多种植物基因组DNA的提取与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增实验,尤其适用于大样本量的规模化基因型鉴定.

植物miRNA参与调控作物农艺性状的研究进展

植物microRNA (miRNA)是一类长度约为20～24 nt的内源非编码小RNA,它们通过在转录后水平调控靶基因的表达,在植物的生长发育、逆境响应和环境适应等过程中起着关键作用. miRNA对水稻、玉米、大豆等重要经济作物的农艺性状也起着重要的调控作用,在改良农作物性状上具有重大的应用潜能.本文重点介绍了参与作物农艺性状(如株型、花期、种子发育及抗逆等)调控的关键miRNA及其调控途径,同时总结了miRNA参与作物性状改良的主要研究方法和手段,并讨论了miRNA在作物性状改良应用中的前景.

裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸机理研究进展

二十二碳六烯酸(DHA)属于ω-3不饱和脂肪酸,是保持人体健康的重要营养成分之一,具有重要的医药应用和营养价值。与植物和动物来源相比,裂殖壶菌合成DHA的工业应用前景广阔。研究表明,过表达聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)途径中的关键作用酶基因与改变培养条件(如碳源、氮源、温度、无机盐、微量元素、前体物质及生物促进剂等),均可显著提高DHA产量。此外,不同限制条件下的裂殖壶菌基因组及转录组的测序分析,揭示了DHA合成过程种不饱和双键形成、信号传导、脂质转运及代谢的分子机制。

植物microRNA响应非生物胁迫研究进展

非生物胁迫是影响植物生长和产量的主要因素之一,而microRNA(miRNA)在植物的非生物胁迫应答中具有重要的调控作用。miRNA可与靶基因mRNA互补配对结合,通过切割靶基因mRNA或抑制其翻译的方式,在转录后水平上实现对靶基因表达的调控,进而对植物的生长发育、形态建成以及逆境响应等多个方面产生重要影响。综述了植物miRNA的合成、降解及作用机制的研究进展,并对植物miRNA参与的干旱胁迫、盐胁迫、高温与低温胁迫、养分胁迫和金属离子胁迫等非生物胁迫的应答机制进行了详细阐述,并就当前植物miRNA研究中存在诸如miRNA代谢的亚细胞定位不明、功能研究手段单一以及逆境胁迫响应机制研究不深入等问题指出了未来该领域研究的发展趋势。

拟南芥JAG基因调控花器官中叶绿素a与b比例

拟南芥C2H2锌指家族转录因子JAGGED(JAG)基因是植物发育过程中调控细胞分裂和分化的一个关键基因.为更详细了解JAG基因在植物发育调控中的功能,解析其下游的调控网络,通过对JAG基因诱导过表达植物的花器官进行分析,发现除在花器官形态上表现出差异外,JAG基因还可促进叶绿素a(chlorophyll a,Chla)转变为叶绿素b(chlorophyll b,Chlb).进一步研究发现,调控从Chla向Chlb转化的关键基因CAO的转录水平受JAG转录因子的间接作用会显著上调,从而使花器官中Chla和Chlb比例改变.对比分析JAG下游基因库转录组数据和Ch IPseq结果,找到了23个受JAG直接作用的叶绿体发育相关基因.研究结果表明,JAG基因对植物花器官中叶绿素的生成有重要作用,可通过间接调控CAO基因的表达,控制Chla和Chlb的比例.该工作可为研究JAG基因调控植物器官发育及功能的基因网络提供新启示.

镉胁迫下菜心的转录组分析

为研究菜心吸收和转运镉的机制,对镉胁迫前后菜心叶部和根部的转录组进行高通量测序及差异表达分析,共获得3 854个差异表达基因. GO (gene ontology)富集分析显示,差异表达基因主要富集在与次生代谢物合成、氧化还原反应、光合作用、铁离子稳态及木质素或木栓质的合成及代谢等有关的GO条目中. KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析结果表明,差异表达上调基因主要富集在植物病原菌互作、植物信号传导、木栓质等物质的生物合成和谷胱甘肽代谢等通路中;差异表达下调基因主要富集在光合作用、核糖体、生物素代谢、脂肪酸的生物合成和芥子油苷的生物合成等通路中;这些差异表达基因可能与菜心应对镉胁迫的生理生化反应相关.分析了菜心在镉胁迫下响应的主要通路及基因,为进一步探索菜心镉胁迫响应机制、培养低镉积累的菜心品种提供理论基础.

植物激素处理诱导的转录组改变揭示铁皮石斛β葡糖苷酶在多糖合成中的关键作用

目的铁皮石斛是一种名贵的中草药,药用历史悠久,其药用活性成分主要包括多糖、类黄酮和生物碱。这些成分的种类和含量通常受到诸多环境因素的影响。组织培养中植物激素的广泛使用促进了许多兰科植物的大量快繁,然而植物激素对活性成分积累的影响及其作用机制尚待进一步深入研究。方法本文利用铁皮石斛组织培养常用的两种植物激素NAA和(/或)6-BA处理铁皮石斛幼苗,测定活性化合物含量并对相应材料进行转录组测序分析。结果激素处理影响多糖、生物碱和类黄酮等活性化合物的积累水平,同时引起较多的差异基因表达。统计分析表明,6-BA较NAA处理引起更多的转录本改变,β葡糖苷酶编码基因BGLU表达与多糖积累密切相关。进一步功能研究表明,包括激素种类、处理浓度、处理时间和处理材料生长时期等因素均能明显影响BGLU表达及相应多糖积累水平,从而在分子层面部分回答了一个长期困扰人们的关键问题,即为什么药材经组织培养后活性成分相对不稳定。结论本研究明确提出了BGLU在激素处理后多糖的积累过程中有重要调控作用。

核苷酸转移酶与玉米非生物胁迫响应

核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3'末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.

ShRNA-LDH纳米颗粒的制备及薇甘菊生物防治

核糖核酸干扰(ribonucleic acid interference,RNAi)技术在植物保护中具有高效、安全和环保的特点.外源喷施短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)可以有效沉默薇甘菊(Mikania micrantha)叶绿素a/叶绿素b结合蛋白相关基因.为提高喷施shRNA对薇甘菊的防治效果,制备直径为10~100 nm的层状双氢氧化物(layered double hydroxide,LDH)黏土纳米片为shRNA的载体,该载体具有良好的生物相容性,具环境友好.研究发现,LDH结合shRNA的最佳质量比为1∶10.shRNA喷施实验表明,有轻微创伤的薇甘菊叶片对shRNA更敏感,并且LDH直接喷施对薇甘菊的生长几乎没有任何影响.为比较LDH-shRNA和单独的shRNA对薇甘菊的控制效果,利用分别搭载了6个shRNA的LDH纳米颗粒或单独的shRNA喷施薇甘菊叶片,在喷施6 d后观察到叶片喷施LDH-shRNA有更加明显的坏死表型.研发的基于LDH的shRNA携带系统可显著提高RNAi在防控薇甘菊中的有效性.

利用多不饱和脂肪酸制备新型鱼饲料的研究进展

多不饱和脂肪酸作为鱼类必需的一种营养物质,在提高鱼类繁殖能力,促进生长发育,增强免疫力方面发挥着重要作用。由于鱼自身不能合成多不饱和脂肪酸,只能通过摄食获取,因此在水产养殖中,用多不饱和脂肪酸添加制备新型鱼饲料,提高养殖效益极具前景。文章就多不饱和脂肪酸的种类、结构、性质及其在鱼类养殖中的功能、新型饲料制备及工艺,对国内外的相关研究进行综述。

microRNA在玉米生长发育及非生物胁迫响应中的调控功能

microRNA (miRNA)是一类广泛存在于真核生物中长度为20~24 nt的内源非编码小RNA,它们通过对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制,在转录后水平调控靶基因的表达。近期研究表明,miRNA参与植物生长发育与逆境胁迫响应的多个重要生物学过程,对作物的农艺性状也起到重要的调控作用。玉米作为重要的粮食、饲料和工业原料,提高其产量和品质对于保障世界粮食安全至关重要,然而与模式植物拟南芥和水稻相比,玉米中miRNA的研究仍然相对较少,理解miRNA在玉米中的功能和调控机理有助于通过分子育种对关键农艺性状进行遗传改良。本文综述了玉米中miRNA的发现与鉴定,系统总结了参与玉米miRNA代谢途径的关键蛋白DCL、AGO和HEN1的研究进展,重点阐述了在玉米生长发育和非生物胁迫响应过程中已开展功能研究miRNA的调控作用,并对玉米miRNA研究当前存在的问题和未来的发展趋势进行了讨论。

日本结缕草耐盐基因ZjbHLH106的克隆及序列分析

bHLH106隶属于Basic helix-loop-helix(bHLH)超家族成员,是一类耐盐相关的转录因子。以日本结缕草为研究对象,通过将拟南芥AtbHLH106与日本结缕草基因组的同源序列比对,鉴定到了日本结缕草ZjbHLH106基因(Zjn_sc00014.1.g08160.1.sm.mk),利用RT-PCR法,从日本结缕草中克隆出该基因序列。结果显示,ZjbHLH106基因编码区(CDS)的长度为747 bp,有2个外显子和1个内含子;蛋白序列包含了1个典型的bHLH结构域;启动子区域包含了多种生物进程相关转录因子靶位点,包括生物胁迫、非生物胁迫、生长素调控等;ZjbHLH106基因响应盐胁迫诱导,参与了结缕草盐胁迫相关的生物学反应。对ZjbHLH106基因的克隆和研究可为日本结缕草耐盐相关的研究提供理论依据。

肝细胞癌患者乙型肝炎病毒再激活与诊疗

乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)患者在接受免疫检查点抑制剂等药物治疗过程中可发生HBV的再激活。HBV再激活后会诱发炎症等,造成肝功能损害甚至肝衰竭,导致抗HCC治疗的中断或延迟,严重影响患者预后。HBV再激活的发生机制极其复杂,通常认为由机体受到自身或外界因素作用导致的免疫力降低引起。虽然抗HBV药物抑制HBV复制的效果显著,但HBV再激活事件常有发生。因此,深入研究并总结HBV再激活相关机制、影响因素以及抗病毒方案的选择,有助于更好地管理HBV再激活。

植物非典型Aux/IAA蛋白应答生长素研究进展

植物激素生长素调控植物生长发育及环境适应的多个过程,包括胚胎发育、器官发生和向性生长等。生长素发挥生物学功能主要依赖于经典的TIR1/AFB-auxin-Aux/IAA-ARF信号转导途径。其中,由4个保守结构域组成的典型Aux/IAA蛋白作为TIR1/AFB的共受体在生长素信号转导过程中发挥关键作用。然而,近年来发现缺乏保守结构域的非典型Aux/IAA蛋白也参与生长素的应答与调控作用。该文从蛋白结构、生物学功能及参与生长素信号转导等方面综述了非典型Aux/IAA蛋白的研究进展,探讨和展望了非典型Aux/IAA蛋白的研究方向。

日本结缕草miR156和SBP基因的全基因组鉴定及分析

SQUAMOSA启动子结合蛋白(SQUAMOSA-promoter binding like proteins, SBPs/SPLs)是植物中一类重要的转录因子家族,它的部分成员在microRNA156 (miR156)的调控下参与到植物各类的生物学过程,包括逆境胁迫、花芽分化以及花形态建成等。本研究以日本结缕草(Zoysia japonica)基因组为基础,通过对SBP蛋白保守结构域的相似性分析鉴定到了20个Zj SBP家族成员,蛋白的氨基酸长度为203~902 aa,相对分子质量介于22~96 k D之间,等电点为5.26~10.24。通过miRNA的预测分析鉴定到了14个日本结缕草Zja-miR156;通过序列特性及靶向分析,发现其中8个SBP成员为miR156的靶基因。对日本结缕草、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana) SBP蛋白进行系统进化学分析,发现它们可被划分为8个进化亚群。对日本结缕草miR156、SBP成员的鉴定及分析有助于深入挖掘miR156和SBP生物学功能,并为提高结缕草分子改良育种提供数据基础。

微生物学“小规模限制性在线开放课程+对分课堂”混合教学模式的探索与实践

互联网时代下新兴技术推陈出新,传统讲授型课堂面临诸多挑战。秉承“教”与“学”并重的理念,深圳大学微生物学课程探索并初步实践了“小规模限制性在线开放课程(smallprivate online course,SPOC)+对分课堂”混合教学模式。综合两种教学方法的优势,对微生物学课程的教学内容按照“课前、课中、课后”三大模块进行了系统重构,将每个教学单元设计为讲授(presentation,P)-内化吸收(assimilation,A)-温故知新(review,R)-讨论(discussion,D)-讲授(presentation,P),即P-A-R-D-P这5个环节,其中课前P-A环节采用线上SPOC、课中R-D-P采用对分课堂形式。这样的混合教学模式既不忽视传统课堂中教师系统传授知识的重要性,也不完全让学生自学,打造了教师充分设计、学生充分参与的良性互动课堂氛围,有利于实现教师与学生两个主体达到“教”与“学”及“权”与“责”上的动态平衡,获得了学生的充分肯定,达到了较高的教学满意度。