线粒体动力学失衡和环境神经毒物对阿尔茨海默病病理进程影响的研究进展

线粒体动力学指细胞中的线粒体不断进行分裂融合的一种动态变化,是维持胞内物质与能量运输的重要保障,发动蛋白相关GTP酶1、Fis1、线粒体分裂因子、线粒体融合蛋白1/2和视神经萎缩蛋白1等蛋白为这一过程的直接参与者,它们受到磷酸化、S-亚硝基化、泛素化、小泛素化和蛋白酶解等信号的精密调控。神经细胞的突触形态与功能维持极度依赖线粒体正常分布与功能,而体内外神经毒性物质可能通过干扰线粒体动力学平衡引发神经元能量代谢障碍,活性氧释放增多,并可加速细胞凋亡。越来越多研究表明,线粒体动力学失衡是阿尔兹海默综合征早期病理进程中的关键事件之一。

多肽组学技术在体液生物标志物中的研究进展

多肽组学是蛋白质组学技术的延伸,理论上是指器官、组织、细胞和体液中分子质量小于10 ku的全部内源性多肽。体液多肽组包含了丰富的人体病理和生理信息,自2000年提出生物标记物研究以来,引起了研究者的广泛关注。本文对多肽组学的研究方法和3种体液多肽组生物标志物的发展和应用进行总结,提出多肽组的宽泛性,探讨利用肽段分子质量作为标记物的缺点,指出在多肽组分析的各个步骤都可能引入一定的不确定性。

室内观赏鱼池自净化生态系统的构建

[目的]构建室内观赏鱼池生态自净化系统。[方法]设计了水泵过滤池、入水池、生态净化池和观赏鱼池。结合使用常规水族生物材料,首次在生态净化池投放了单肠目、大口虫目、三肠目涡虫、水螅和浮游动物等。对常见5种水生观赏植物以及硝化细菌的水净化功能进行检测。[结果]实现了鱼池环境物种的多样性,形成了完整的食物链体系,使观赏鱼池获得稳定的水生态平衡环境,构建了具有自净化功能的水生态调控系统。不同的水生观赏植物对水体的净化功能有显著差异。[结论]构建的室内观赏鱼池自净化生态系统方法简便、效果极为显著,可节约人工及水资源均达90%以上,具有应用与推广价值。

阿尔茨海默病的防治策略研究进展

评述了阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的多种病因学说,包括胆碱能学说、β-淀粉样级联学说、ABC学说(aging,beta-amyloid,channel)、tau蛋白过度磷酸化学说、氧化应激学说、神经细胞凋亡学说和基因突变学说等.指出AD是多因素引起的病变,其发病机制也必然有多种.由于该病与人体衰老过程密切相关,发病机理复杂,且神经细胞丢失后不具再生能力,这就决定了研究治疗AD有效药物的艰巨性.还指出AD防治工作应重视早期预报和早期干预,发展早期诊断方法包括正电子发射计算机断层扫描、磁共振成像,及血液和尿液中寻找灵敏的生物标志物等技术方法.目前有关AD防治药物包括一线治疗药物、疫苗、尚在研究阶段的药物、辅助性治疗药物、中药以及医疗保健品.前3类药物因疗效或研究结果长期未取得突破性进展,人们开始关注后3类药物对延缓AD的作用及机理.课题组重点开展后3种药物防治AD的作用和机理研究,发现硒代蛋氨酸、辅酶Q-10和中药组分淫羊藿甙对防治AD有好的疗效.综述了目前抗AD药物的研究现状和面临的挑战,提出AD的防治策略是:摒弃针对单一致病因素的治疗思路,从多因素及内在相互联系的系统生物学角度,开展AD防治机制及新药研发.

雨生红球藻抗氧化系统对活性氧的清除机制

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水单细胞绿藻,隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。它受强光、氮饥饿、高盐等胁迫时积累大量的虾青素,含量可高达细胞干重的6.0%以上[1]。相关研究也显示来虾青素具有极强的抗氧化活性[2—4],它的抗氧化活性较α-生育酚强千倍[5],比维生素E高近百倍[6]。

北部湾海域水质综合污染指数和浮游植物多样性指数评价

【目的】探讨环境污染评价方法,以期反映广西北部湾海域污染水平的客观情况,推进海洋生态环境质量评价方法的进一步发展,为该海域的环境生态研究以及富营养化问题研究提供依据。【方法】利用水质综合污染指数和浮游植物多样性指数分别对广西北部湾海域2010年6月和2010年9月调查的数据进行污染程度评价,并讨论利用多样性指数评价的合理性。【结果】广西北部湾海域污染等级处于轻中污染至无污染之间,其中利用水质化学因子进行综合评价的结果为轻污染,利用浮游植物多样性指数进行评价的结果为轻中污染至轻污染或无污染。【结论】水质化学评价与水质生物学评价在海域污染程度上存在一定的偏差。利用浮游植物多样性指数评价海域水质污染程度,其评价标准仍有待更多的调查来验证和修正。在实际评价中不能单从指数结果就轻易下定论,应结合理化监测结果,才能得到实际结论。

溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析了溶菌酶标准蛋白,在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段,Mascot得分420,鉴定覆盖率为54%。此外,经人工解析发现,肽段IVSDG-DGMNAWVAWR(98→112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰,在激光解吸电离过程中发生脱水反应,脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外,还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明,选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据,有可能发现一些特殊的蛋白质修饰,可增加数据利用度和分析结果的确定性。

利用基因工程技术提高微藻油脂含量的研究进展

利用微藻油脂制备生物柴油因具有重要的战略意义而受到世界各国的重视,成为近年来的研究热点。利用微藻制备生物柴油具有生长周期短、易于大规模培养、能大量吸收CO2及不占用耕地等优点。但是,由于对藻类油脂合成代谢中的调节机制了解不多,导致微藻基因组研究相对滞后,极大地限制了微藻生物能源的大规模开发和利用。随着现代生物技术的发展,通过基因工程、代谢工程等方法调控微藻脂类的合成代谢,提高藻类含油量和生物量已成为可能。概述了微藻中油脂的合成代谢,归纳总结利用基因工程技术提高微藻油脂含量的研究进展,为获得含油量高的工程微藻及微藻制备生物柴油提供技术储备。

蛋白质胰蛋白酶水解过程双位点漏切肽段的质谱鉴定

为说明胰蛋白酶漏切位点数目设置对蛋白质搜库结果的影响,采用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了细胞色素C和大豆脱落胁迫成熟蛋白。在细胞色素C和大豆脱落胁迫成熟蛋白的胰酶水解液中分别发现了2个和4个双胰酶漏切位点肽段,确认了文献中报道的当赖氨酸和赖氨酸相邻或赖氨酸、精氨酸各自与天冬氨酸或者谷氨酸相邻时,会引起胰蛋白酶的漏切。此外,还发现组氨酸-赖氨酸-异亮氨酸/丙氨酸结构也有此现象。本研究中检测出漏切肽段并没有明显提高序列覆盖率,但显著增加了蛋白质鉴定结果的确定性。在实际样品分析中如将漏切数设置为1有可能产生肽段鉴定的假阴性。

SEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析

通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal entero-toxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列sec2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124sec2t,采用'珠磨法'将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10μg/mL Zeomy-cin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-sec2t.Southern blot和Western blot分析表明,sec2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-sec2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-sec2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生;与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.

纳升液相色谱-质谱分析方法的重现性对尿液多肽组分析结果的影响

多肽组学是蛋白质组学技术的延伸和扩展,在医学和生物学研究中的应用日益广泛,但是,多肽组鉴定方法的重现性对实验结果的影响目前尚不清楚。本研究利用纳升液相色谱-高分辨质谱对健康人的尿液多肽组进行了7次平行分析,考察图谱数目、图谱利用率、鉴定的肽段数目、蛋白质数目、样品总离子强度和肽段保留时间等指标的变化,以揭示重复实验之间分析结果的可变性和稳定性。7次测定的肽段数目平均值为208,标准偏差为38;7次结果合并后,得到了归属于114个蛋白质的426个肽段,肽段和蛋白质数目均显著增加;而35个蛋白质的109个肽段在所有7次实验中均被检出,表明多肽组的单次分析结果既具有一定的随机性,又具有相对的稳定性。增加平行实验次数会扩大多肽组数据集,但测定3次以上后增加幅度减小。相比于肽段,多肽组的结果在蛋白质水平上更为稳定,提示利用蛋白质为多肽组的生物标志物更为稳健。

串联飞行时间质谱中亚胺离子的断裂特征及其在肽段鉴定中的作用

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)产生的亚胺离子可以提供丰富的肽段组成信息,该方法通常用于基于数据库搜索的蛋白质鉴定,或者结合化学衍生法用于从头测序,因而在一定程度上限制了对亚胺离子的认识及应用。本研究利用239个串联质谱探索MALDI-TOF/TOF中亚胺离子的断裂特征以及它们在肽段鉴定中的应用,发现在高能碰撞诱导解离条件下组氨酸等14种氨基酸可产生较强的亚胺离子信号(>50%阳性率),氨基酸的化学结构、位置效应和氨基酸残基个数是影响碎片离子强度的主要因素。此外,探讨了亚胺离子应用过程中的假阳性问题,提出亚胺离子相对强度的比较可以降低假阳性和提高肽段鉴定确定度,有助于完善目前的数据库搜索算法和辅助从头测序分析。

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。

谷氨酸甲基化修饰的基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了枯草芽孢杆菌中的蛋白酶抑制剂和杆菌肽F两种蛋白及其翻译后修饰,发现在这两种蛋白质中共有5个肽段发生谷氨酸甲基化,其中肽段FELVVYDSEHK存在FE(Methylation)LVVYDSEHK和FELVVYDSE(Methylation)HK两种形式。结果表明,MALDI-TOF/TOF高能CID所提供的丰富断裂信息和全质量范围扫描对提高分析结果的确定性具有重要作用。此外,这5个甲基化肽段都可以检测到相对含量更高的非甲基化肽段,这为降低分析结果的假阳性提供了辅助判据。在低质量区检测到甲基化赖氨酸的亚胺相关离子m/z 98和143,说明发生了赖氨酸的甲基化;检测到m/z 116则提示发生了谷氨酸甲基化。

一种莱茵衣藻启动子功能检测系统的构建

选用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作为检测微藻启动子功能的生物系统,以pSP124质粒为基础,雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt1的启动子片段(450 base pair,记作450 bp)为间隔序列,引入两个Eam 1105Ⅰ限制性内切酶位点,构建莱茵衣藻启动子功能检测T载体.将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的1 986 bp的bkt1启动子片段直接克隆到T载体上,通过"珠磨法"转化到莱茵衣藻CC-849中,经Zeomycin筛选获得了TranB-0.45和TranBle转基因藻,而1 986 bp的bkt1启动子无转化子,原因可能是其含有负调控元件.PCR结果显示,ble可稳定存在于转基因藻中,bkt1启动子的450bp片段具有启动子活性,能正确表达BLE蛋白.该研究表明,莱茵衣藻和pB-0.45T载体所组成的检测系统可用于藻类启动子研究,为启动子功能的研究提供了一条新途径.

花生过敏原Ara h1的热变性及其与还原糖相互作用的研究

运用圆二色光谱(CD)和荧光光谱以及ELISA方法对花生蛋白Ara h1的热变性及其与还原糖的相互作用,以及过敏原性的变化进行了系统研究。实验表明,温度高于85℃时,Ara h1蛋白的二级结构才发生显著变化,表现为α螺旋结构的相对含量减少,β折叠及无规卷曲等结构的相对含量增加,其过敏原性也相应降低;木糖、果糖能与Ara h1蛋白进行相互作用进而有效稳定其蛋白结构,并显著降低其过敏原性。研究结果对食物过敏原致敏机理的深入研究,以及花生食品的合理加工具有重要的理论指导意义。

水螅体表鳃隐鞭虫的安全清除方法

鳃隐鞭虫Cryptobia branchialis常寄生在鱼鳃上,易导致鱼类窒息死亡。中性红是一种易氧化分解的常用活体生物染色剂。本研究以普通水螅Hydra vulgaris为材料,使用中性红溶液,探索有效清除水螅体表鳃隐鞭虫的安全浓度与使用方法。结果表明：中性红浓度20~30 mg·L-1（25℃±1℃）时10 min可有效清除鳃隐鞭虫,且不影响水螅的正常生长。中性红浓度为20~50 mg·L-1时,触手出现解体的对应时间为30-10 min。研究表明,中性红溶液浓度与处理时间科学组合,能达到安全高效杀灭水螅体表寄生原虫的目的。

人唾液蛋白质组的纳升液相色谱-高分辨串联质谱鉴定及高丰度蛋白质分析

常规的定性分析质谱数据能否以及如何应用于蛋白质组学的相对定量分析是实际工作中经常遇到的问题。本研究采用一维纳升液相色谱-高分辨串联质谱(nano-HPLC-Triple TOF 5600)法鉴定人唾液蛋白质组,并分析其基本组成,以探讨质谱数据与唾液中高丰度蛋白质的相关性。本实验共鉴定了6 044条特异性酶切肽段,归属于α-淀粉酶1、碳酸酐酶6、血清白蛋白、粘蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白等各种已知的高丰度蛋白质在内的521个蛋白,这为一维纳升液相色谱分离条件下的唾液蛋白质组的基本组成分析提供了参考。结果表明,仅用蛋白质排序指标Unused值表征蛋白质的相对含量具有局限性,而蛋白质排序、检出肽段数目和肽段平均强度等综合指标与蛋白质相对含量具有正相关性,即排名较后的蛋白质均只有1条肽段被检出,且肽段强度较低。这说明,当蛋白质相对含量差别较大时,肽段的化学性质和电离效率差异对质谱信号的影响已不占主要地位,即可以认为当肽段检出数目、鉴定覆盖率和肽段强度均较低时,蛋白质的相对含量也较低。该结果可为利用Triple TOF 5600质谱仪的定性鉴定数据进行初步半定量判断提供参考,也可为唾液蛋白质组生物标志物研究提供借鉴。

雨生红球藻基因组文库的构建及鉴定

本研究以雨生红球藻34—1n为材料，提取其基因组DNA，利用限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行酶解，回收6～8kb的基因组DNA片段，并浓缩至200ng／i,zL。该片段与经BamHI酶切和去磷酸化处理后的pUC18载体连接，然后电击转化到受体菌Escherichia.coliDH5仅中，获得雨生红球藻34-1n的基因组文库。该文库的平均插入片段长度约为6．5kb，获得6x10s个克隆数。通过PCR筛选，由雨生红球藻基因组文库中获得含bktl序列的单克隆菌，与β-胡萝卜素氧化酶序列（GenBank：DQ086233．1）进行比对，结果表明bktl基因组序列含有6个外显子。本研究为进一步鉴定雨生红球藻相关基因提供了一个文库平台。

亚胺及其相关离子在区分赖氨酸和谷氨酰胺残基中的应用

完全从头测序要求区分肽段中的同量异序氨基酸谷氨酰胺和赖氨酸,而这通常需要借助高分辨质谱。谷氨酰胺和赖氨酸都可以产生m/z 101亚胺离子和m/z 84亚胺相关离子,尽管已知赖氨酸亚胺离子m/z101有时强度较弱,以及m/z84离子可预示赖氨酸的存在,但该特征能否用于区分赖氨酸和谷氨酰胺仍存在争议。本工作以合成肽段和蛋白质胰酶水解肽段为研究体系,利用基质辅助激光解吸电离的高能碰撞诱导解离模式产生的亚胺及其相关离子的相对强度区分这两种氨基酸。结果表明:谷氨酰胺更易产生m/z101离子,而赖氨酸更易产生m/z84和m/z129离子。对于不同时含有赖氨酸和谷氨酰胺的肽段,使用m/z84离子与亚胺离子m/z101的相对强度比值,而非它们的绝对强度,以及m/z101离子的测量值,可以直接判断序列中存在的是赖氨酸还是谷氨酰胺。对于含有谷氨酰胺,并以赖氨酸结尾或含有漏切赖氨酸的肽段,该强度比可为序列中谷氨酰胺的个数和位置提供参考。因此,低质量区提供的亚胺及其相关离子信息有助于区分赖氨酸和谷氨酰胺。