TTV感染:病毒性肝炎研究的新热点

1997年12月日本学者Nishizawa等应用代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)从1例不明病原的输血后肝炎病人的血清中首次获得一个新的病毒基因克隆(N22)。经与基因库中已登记的序列比较,未发现相同或相似的基因序列。

大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体的构建及其对HSC-T6细胞TIMP1表达影响的研究

目的构建大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体,并观察其转染HSC-T6细胞后对TIMP1基因表达的影响。方法根据BLOCK-iT Poll miR RNAi Expression System with EmGFP要求,应用在线miRNA设计工具http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/,针对大鼠TIMP1基因(GenBank:U06179)的598位点设计、合成Oligo DNA,退火形成双链DNA后,与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接,转化Top10感受态细胞,构建TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体。经PCR扩增及测序鉴定正确后,以脂质体LipofectimineTM2000介导转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,24、48、72h后收集细胞,应用RT-PCR鉴定TIMP1的表达情况。结果经PCR及测序鉴定构建的TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体正确;将其转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6,48 h即可见TIMP1 mRNA表达量下降,72 h检测不到TIMP1 mRNA的表达,而未转染组及转染pLacZ-miR/GFP(阴性对照)组未见此改变。结论成功构建大鼠TIMP1 miR-NA慢病毒RNAi载体pTIMP1-miR/GFP;pTIMP1-miR/GFP使大鼠肝星状细胞株HSC-T6 TIMP1基因沉默。提示了RNA干扰可使肝纤维化形成过程中的关键因子TIMP1基因沉默,为RNA干扰技术进一步应用治疗大鼠肝纤维化模型奠定了基础。

乙肝病毒定量分析的临床应用研究

目的 :研究血清乙肝病毒 (HBV)的含量与HBV -DNA致病的关系及HBV -DNA含量与丙氨酸氨基转移酶(ALT)的相关性。方法 :以聚合酶链反应 (PCR)法对乙肝患者的血清进行HBV -DNA定量分析 ,同时检测ALT及乙肝两对半。结果 :大多数无症状携带者 (ASC)及HBeAg 阳性的乙肝患者的病毒血症水平较高 ,抗 -HBe阳性的慢性肝炎及肝硬化患者病毒水平依次减低 ,HBeAg 阳性及ALT的异常检出率随HBV -DNA滴度升高而增加。结论 :HBV

DMG光固化氢氧化钙修复前牙陈旧性根管穿孔疗效研究

目的探讨DMG光固化氢氧化钙修补前牙陈旧性根管穿孔的临床效果及可行性。方法对38颗前牙陈旧性根管穿孔经唇侧根面采用DMG光固化氢氧化钙进行修补,定期回访,观察治疗效果。结果随访1～1.5年,成功34颗,失败4颗。结果使用DMG光固化氢氧化钙修补前牙陈旧性穿孔,对患牙保存短期疗效好,长期效果有待于进一步观察。

高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学表现特点

目的探讨高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学检查方法及胸部X线与CT影像表现特点。方法回顾性分析2006年6月深圳接诊的首例由卫生部确诊,并经过抢救治疗痊愈的高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎患者的相关临床及影像学资料。结果胸部影像学特点是:①磨玻璃样影、大小片状影及肺实变影是人禽流感病毒性肺炎较早出现的影像表现;②病灶侵犯肺组织广泛,表现为多叶多段的两肺广泛受累;③病灶蔓延变化迅速;④肺实质、肺间质及胸膜受累可同时存在;⑤病灶吸收慢、迁延时间长,恢复期有肺纤维化的影像表现。结论影像学检查与诊断仍然是人禽流感病毒性肺炎的临床诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后分析的重要手段。动态观察人禽流感病毒性肺炎的影像学变化及影像学表现特点,监测ARDS和肺部继发感染等并发症的发生,利于指导临床及时有效地进行治疗。

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植模型大鼠移植区域组织损伤的修复作用

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)注入后在异基因肝移植模型大鼠移植区域的迁徙、定居及组织修复作用,探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法将昆明小鼠肝组织块埋入Wister大鼠肝脏切口,制备异基因肝移植大鼠模型;体外分离、纯化并培养昆明小鼠乳鼠MSCs;经DAPI标记后,尾静脉注入模型大鼠,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在肝脏移植区域的迁徙及定居;采用HE染色观察肝移植区域组织损伤情况。结果MSCs尾静脉注入后,24h即出现在肝移植区域,5d时分布于血管周围,10d时扩散至移植区域血管及周围组织;MSCs治疗5d,HE染色显示移植区域浸润的炎性细胞减少,可见肝组织结构。结论小鼠MSCs可在大鼠体内存活,并参与损伤区血管及组织的修复。

应用荧光定量PCR技术检测HBVDNA低拷贝样品及临床意义分析

目的:观察荧光定量PCR技术对HBVDNA低拷贝样品检测的情况并探讨其临床意义。方法:采用荧光定量PCR和改良PCR法对一系列不同拷贝数的临床标本平行进行检测。结果:在电泳分析时PCR产物的亮度与样品的拷贝数呈正相关,>103copies/ml的样品能经PCR扩增得到明亮的特异产物条带,103copies/ml的样品也可得到特异的弱条带,但102copies/ml的样品无法检测到特异产物,并有明亮的引物聚合体产生。结论:荧光定量PCR技术的检测准确下限为104copies/ml,103copies/ml的样品检测时存在很大的随机性,这种条件下的样品并不能用荧光定量PCR的方法进行准确检测,应该采用其他更灵敏的方法。

应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验

目的建立流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验的方法。方法利用结核分枝杆菌水解FDA的特点，选用FDA作为荧光染料，用流武细胞术检测H37Rv标准株，临床分离到的20株结核分枝杆菌对RFP、INH、SM和EMB的敏感性，根据细菌培养物在不同浓度药物作用后所检测到的平均荧光强度与阳性对照的比值，从而推断MIC值，并于传统的绝对浓度法检测结果进行比较。结果20株结核分枝杆菌的流武细胞术所得药敏试验结果与绝对浓度法基本一致。结论所建立的流武细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验可以应用于临床，并有快速、准确、方便的优点。

灭活HIV-1颗粒对人CD4^+T细胞活化标记分子CD25、CD71和HLA-DR表达的作用

目的通过深入研究AT-2灭活HIV-1颗粒对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PB-MCs)来源的CD4+T细胞中期活化标记分子(CD25)和晚期活化标记分子(CD71和HLA-DR)的作用,进一步探讨HIV病中普遍性的免疫过度活化的病理机制。方法AT-2灭活HIV-1IIIB型病毒颗粒,ELISA法检测p24抗原的含量,调整p24抗原含量为50 ng/mL;然后按照p24抗原量为0.1 ng/mL(记作HIV-1 1/500组)、1 ng/mL(记作HIV-1 1/50组)和10 ng/mL(记作HIV-11/5组)的浓度加入到PBMCs中,以植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)组为阳性对照,24 h后,运用免疫荧光抗体染色技术结合流式细胞术检测PBMCs中CD4+T细胞CD25的表达百分率;48 h后,运用免疫荧光抗体染色技术结合流式细胞术检测PBMCs中CD4+T细胞CD71和HLA-DR的表达百分率。结果24 h后,空白对照组中,CD4+T细胞CD25的表达百分率为(9.46±2.12)%,PHA组为(79.45±3.72)%,HIV-1 1/500组为(14.89±2.53)%,HIV-1 1/50组为(19.04±2.41)%,HIV-11/5组为(23.50±2.21)%;48 h后,空白对照组中,CD4+T细胞CD71的表达百分率为(3.39±1.40)%,PHA组为(75.52±5.14)%,HIV-1 1/500组为(11.70±2.34)%,HIV-1 1/50组为(18.45±3.19)%,HIV-1 1/5组为(22.59±2.96)%;CD4+T细胞HLA-DR的表达百分率为(8.11±2.13)%,PHA组为(66.48±6.81)%,HIV-1 1/500组为(14.52±1.68)%,HIV-1 1/50组为(19.94±2.38)%,HIV-1 1/5组为(23.74±2.30)%。结论AT-2灭活的HIV-1IIIB颗粒能够明显的诱导PBMCs中CD4+T细胞活化,并可能引起CD4+T细胞增殖,从而为HIV-1感染提供更多的"燃料细胞"。

不同人群结核分枝杆菌潜伏感染特异性IFN-γ检测分析

目的采用早期建立的特异性结核菌抗原IFN-γ Elispot检测技术,对深圳市不同人群结核菌潜伏感染的现状进行调查研究。方法采用结核菌特异性Elispot方法检测了34例深圳市某高校学生、18例结核病区医务人员、19例深圳市某IT公司职员、36例深圳市某生物技术公司职员、29例深圳市某公司后勤保安的结核菌抗原特异性IFN-γ反应水平。同时对各组人群还进行结核菌素皮试(PPD皮试)调查作为对照研究。结果各组人群中的Elispot检测阳性率分别是高校学生5.88%、结核病区医务人员55.6%、公司保安人员31.03%、IT公司职员31.57%、生物公司职员19.44%;PPD皮试阳性率为高校学生20.58%、结核病区医务人员88.9%、IT公司职员42.11%、生物公司职员41.67%、公司保安41.38%。结论Elispot检测诊断潜伏期结核分枝杆菌感染优于PPD皮试。

不明病因感染性疾病DNA病毒性病原检测方法的建立

目的建立不明病因感染性疾病DNA病毒性病原的检测方法。方法应用DNaseI-非序列依赖的单引物扩增技术,将患者血清过滤后,经DNase I处理去除血清中内源DNA。Csp6.I酶切病原DNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原DNA,测序并进行序列分析。结果DNaseI处理血清中内源DNA不会降解病毒DNA;非序列依赖的单引物扩增血清中外源DNA得到多个DNA片段;将所有PCR产物测序,序列与已知病原DNA序列完全一致。结论应用DNaseI处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测DNA病毒性病原。

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植后,在异基因肝移植模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓中的迁徙、定居情况及对淋巴细胞增殖的抑制作用,以探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法体外分离、纯化并培养小鼠MSCs;将小鼠肝组织块埋入大鼠肝脏切口,建立异基因肝移植大鼠模型;经尾静脉移植DAPI标记的小鼠MSCs,通过激光共聚焦显微镜观察24 h及5 d时,MSCs在模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓内的迁徙及定居;采用体外淋巴细胞增殖实验检测小鼠MSCs对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用。结果MSCs移植后,24 h即散在分布于胸腺、脾脏及骨髓内,5 d时集中在血管周围;经MSCs治疗后,大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖均受到抑制,与未经治疗的模型大鼠相比,差异有显著意义。结论小鼠MSCs可迁徙至异基因肝移植大鼠免疫器官内,并具有抑制淋巴细胞增殖的作用。

广东深圳市乙型肝炎病毒基因型的检测及意义

目的了解深圳市乙型肝炎病毒(HBV)基因分型情况,探讨HBV基因分型与抗病毒治疗疗效及预后的关系。方法用单克隆抗体ELISA法(mAbsELISA)对143例乙型肝炎病毒感染的患者进行HBV基因分型。结果143例患者中,B型67.8%,C型26.6%。B型多见于无症状乙型肝炎病毒携带者(ASC)(95.4%);C型多见于肝硬化患者(LC)(64.7%)。年龄≤35岁及有乙型肝炎家族史的患者中B型均较C型多见(P<0.05)。拉米夫定治疗的LC中,HBVDNA持续阴性者B型较C型多见(P<0.05)。干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者中,完全应答者B型较C型多见(P<0.05)。25例重型乙型肝炎患者中,B型存活(94.1%)较C型存活(57.1%)高(P<0.05)。结论深圳地区HBV基因分型以B型为主,C型次之。B型多见于年轻患者,C型多见于年老患者,且C型肝硬化患者对拉米夫定疗效差。

用双探针原位杂交法检测常见肝病组织中输液传染性病毒DNA

目的 :建立肝组织输液传染性病毒DNA(TTVDNA)的原位杂交检测技术 ,探讨TTVDNA在肝组织中的分布。方法 :采用PCR扩增法 ,分别合成地高辛标记的G1a、G2b两种亚型的双链TTVDNA探针。同时应用两型探针对 2 2例血清学检查无甲 -庚型肝炎病毒感染的肝病患者肝组织TTVDNA进行原位杂交检测 ,并将检测结果与巢式PCR法检测配对血清TTVDNA的结果进行比较。结果 :原位杂交阳性信号主要定位于肝细胞核 ,少数位于胞浆。 2 2例肝病患者肝组织标本中TTVDNA原位杂交阳性率 6 8 2 % (15 / 2 2 ) ,其中慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中原位杂交阳性率83 3% (15 / 18) ,4例肝破裂、肝良性肿瘤患者TTVDNA原位杂交检测皆为阴性。配对血清TTVDNA阳性率 6 3 6 % (14/ 2 2 )。血清与肝组织TTVDNA检测符合率 86 4 % (19/ 2 2 )。结论 :双探针原位杂交检测具有较高的特异性和灵敏性 ,有助于肝病病因的分析。TTVDNA在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的肝组织中检出率较高 。

DC-SIGNR基因多态性与丙型肝炎病毒载量的相关性研究

目的了解丙型肝炎患者DOSIGN/DC-SIGNR基因颈区重复序列的遗传多态性分布,探讨DC-SIGNR基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)载量的关系。方法采用PCR结合DNA测序对300例丙型肝炎患者DC-SIGNR重复序列多态性进行基因分型和测序分析;同时检测了患者的HCV病毒载量。结果该研究发现携带7等位基因(中等的)的患者,其HCV病毒载量水平低于携带9等位基因(较长的)的患者(P<0.05),此外7/7基因型的患者组其HCV病毒载量水平低于9/7基因型的患者组,两组的差异有统计学意义(P<0.05),提示HCV病毒更易与携带较长DC-SINGR等位基因的患者结合。结论DC-SIGNR遗传多态性可能与HCV病毒在个体内的复制有关。

深圳地区丙型肝炎抗体阳性与病毒RNA水平的关联分析

目的探讨丙型肝炎抗体阳性与病毒RNA水平的关系。方法收集经酶联EIA方法检测丙型肝炎抗体阳性的病人和献血者血清,采用PCR荧光定量检测技术对其RNA水平进行定量测定。结果89份抗HCV阳性血清中,45份RNA定量为阳性,病毒载量各不相同,与年龄、性别、血型无显著性关联,与病人或献血者户籍有关。结论深圳地区丙型肝炎抗体阳性,其病毒RNA水平呈现多样性,RNA阳性率低于报道的国际水平75%,可能与RNA检测试剂的灵敏度有关。RNA水平阳性与是否常住人口有关。

乙型肝炎患者肝组织中Bcl-2、Bax、Bak的表达及意义

目的研究Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｂａｋ蛋白在乙型肝炎（乙肝）肝细胞凋亡及坏死中的作用。方法用免疫组织化学法、原位未端标记技术（ＴＵＮＥＬ）检测８９例各型乙肝患者肝组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｂａｋ表达和肝细胞凋亡的情况。结果肝硬化组（１０例）、急性肝炎组（８例）、慢性肝炎组（５５例）和重型肝炎组（１６例）的ＴＵＮＥＬ实验中度以上阳性率分别为３０．０％，２５．０％，６１．８％和９３８％；Ｂｃｌ－２蛋白表达中度以上阳性率分别为３０．０％，２５．０％，３８．２％和１２．５％；Ｂａｘ表达中度以上阳性率分别为２０．０％，２５．０％，４７．３％和８７．５％；Ｂａｋ表达中度以上阳性率分别为１０．０％，１２．５％，２５．５％和７５．０％。ＴＵＮＥＬ反应及Ｂａｘ、ＢａＫ表达阳性程度在各型乙型肝炎中的分布差异均有显著性（Ｐ＜０．０５），两蛋白的阳性程度随坏死程度的增加而增强。Ｂｃｌ－２在增生区的表达显著高于坏死区。结论Ｂａｘ、Ｂａｋ的加强表达有促进肝细胞死亡的作用，两者的表达水平可反映肝组织损伤和炎症活动程度。

三种乙型肝炎病毒DNA定量聚合酶链反应试剂比较及其假阴性原因分析

乙型肝炎e抗原（HBeAg）是乙型肝炎病毒（HBV）复制的一个标志，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性、HBeAg阳性、抗-HBc阳性的患者体内HBV DNA亦较高。有报道所有该类标本均可检测到HBV DNA，且绝大部分（83．33％）的HBV DNA滴度高于10^6拷贝／ml。然而，我们在对临床标本进行HBV DNA定量检测中发现，相当一部分该类血清标本不能检测到HBV DNA或检测结果低于试剂盒检测下限。为了排除所用试剂盒缺陷造成的可能，我们对目前国内医疗机构常用的三种HBV DNA荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂进行了比较与分析。

HBV DNA及BCP、Pre-C突变株基因芯片检测方法的构建

目的 构建HBVDNA及BCP、Pre C突变株的基因芯片检测方法。方法 该基因芯片检测方法使用了PCR、寡核苷酸芯片二项技术 ,包含了对nt1896、nt 1899、nt186 2、nt176 4、nt176 2五个突变热点的检测 ,并用DNA测序法对该基因芯片进行验证。结果 该基因芯片检测HBVDNA方面结果与DNA测序法 10 0 %相符 ;检测突变株方面 14 6个位点两种方法结果相符 ,4个位点结果不相符 ,P >0 0 5。结论 该基因芯片具有便捷、高通量的特点 ,能同时检测多个BCP、Pre C突变位点。结果提示该基因芯片和DNA测序法检测结果阳性率相等 ,特异性与DNA测序法相当 ,检测混合株有更大优势 ,可用于临床检测。