基于Notch信号通路研究雷公藤多苷对体外培养小鼠卵巢生殖干细胞的毒性作用及机制研究

以优化培养体系中生长状态良好的卵巢生殖干细胞(ovarian germline stem cells,OGSCs)为研究对象,观察雷公藤多苷(Tripterygium glycosides,TG)对OGSCs的影响,并从Notch信号通路探讨其生殖毒性的作用机制。采用cell counting kit⁃8(CCK⁃8)检测3.75、7.5、15μg·mL^(-1) TG对体外培养小鼠OGSCs活力的影响;免疫荧光技术和逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription⁃polymerase chain reaction,RT⁃PCR)检测3.75μg·mL^(-1) TG给药后OGSCs标志物VASA基因同源类似物(mouse vasa homologue,MVH)、八聚体结合转录因子4(octamer⁃binding transcription factor 4,Oct4)蛋白和基因的表达;RT⁃PCR检测Notch信号通路关键分子神经源性基因Notch同源蛋白1(neurogenic locus Notch homolog protein 1,Notch1)、Hes家族BHLH转录因子1(Hes family BHLH transcription factor 1,Hes1)、锯齿典型Notch配体1(jagged canonical Notch ligand 1,Jagged1)基因表达;提取RNA进行转录组学分析TG干预OGSCs的作用机制。3.75μg·mL^(-1) TG配伍40 ng·mL^(-1) Notch信号通路γ⁃促分泌酶激动剂jagged canonical Notch ligand(Jagged)联合给药,采用CCK⁃8检测OGSCs活力水平;免疫荧光双标法检测MVH与Hes1、Notch1、Jagged1蛋白共表达。结果显示,与空白组比较,TG给药后均显著抑制OGSCs活力(P<0.01或P<0.001);显著降低OGSCs标志物MVH、Oct4蛋白和基因表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001);显著抑制Notch1、Hes1、Jagged1基因表达(P<0.001)。转录组学分析提示,TG通过干预Notch信号通路相关配体Jagged1影响OGSCs的生长增殖。实验验证结果表明,配伍Notch信号通路γ⁃促分泌酶激动剂Jagged可显著缓解TG所致OGSCs活力的降低(P<0.001);并与TG组比较,显著升高MVH/Hes1、MVH/Notch1、MVH/Jagged1蛋白共表达(P<0.01或P<0.001)。综上可知,TG可发挥γ⁃促分泌酶抑制剂样作用,通过下调OGSCs标志物MVH、Oct4和Notch信号通路分子Notch1、Hes1、Jagged1参与OGSCs途径介导Notch信号通路诱发生殖毒性。

小鼠卵巢生殖干细胞分离培养鉴定

通过比较不同酶分离方法获得小鼠(Mus musculus)卵巢生殖干细胞的数量以及不同饲养层培养卵巢生殖干细胞的生长状态,筛选出最佳酶分离方法和饲养层,以期建立更优化的培养体系,并对优化培养体系长期培养的卵巢生殖干细胞进行功能鉴定。选取5日龄C57BL/6雌性乳鼠卵巢,机械法制备卵巢组织碎片后,分别采用传统两步酶法(胶原酶和胰蛋白酶)和改良两步酶法(胶原酶、DNA酶、透明质酸酶、分离酶Ⅱ和胰蛋白酶)分离卵巢生殖干细胞,差速贴壁法纯化后,观察不同酶消化方法对卵巢生殖干细胞数量的影响;将分离得到的卵巢生殖干细胞分别培养于小鼠胚胎成纤维细胞STO系[sandosinbred mice(SIM)embryo-derived thioguanine and ouabain-resistant]、多聚赖氨酸以及明胶3种不同的饲养层,观察卵巢生殖干细胞的生长增殖状态;将传至第6代的卵巢生殖干细胞用碱性磷酸酶检测法和免疫荧光法对卵巢生殖干细胞标志物MVH、Oct4、C-kit和增殖标记物Brdu进行鉴定。结果发现两种酶分离方法均可从卵巢中分离得到卵巢生殖干细胞,其中传统两步酶法获得的细胞经差速贴壁法纯化后含卵巢生殖干细胞数量较多;3种不同的饲养层均可使卵巢生殖干细胞生长,其中尤以STO细胞培养的干细胞状态最佳,可在其上生长增殖长达20 d,而多聚赖氨酸和明胶为饲养层培养的卵巢生殖干细胞在培养第5天时出现凋亡。卵巢生殖干细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达,且卵巢生殖干细胞标志物MVH/Oct4、Oct4/Brdu及C-kit蛋白均呈阳性表达。通过传统两步酶法分离得到的卵巢生殖干细胞悬液,经差速贴壁法纯化后,以STO细胞作为饲养层,更有利于卵巢生殖干细胞的生长增殖,且稳定培养后的卵巢生殖干细胞具有正常的生物学功能。