亚甲蓝对人髓核细胞毒性的CCK-8法检测

背景:亚甲蓝在腰椎椎间孔镜手术中具有鉴别及显影退变椎间盘的作用,但是很多专家学者提出亚甲蓝会加速椎间盘的退变,然而国外文献研究发现亚甲蓝具有嗜酸性,推测对具有酸性环境的退变椎间盘具有治疗作用。因此,亚甲蓝对椎间盘是否具有毒性作用一直存在争议。目的:使用CCK-8法测定亚甲蓝对髓核细胞是否具有毒性作用。方法:选取2例椎间盘突出患者的废弃髓核组织,消化后提取髓核细胞,培养至细胞长满培养皿80%后消化细胞并制作细胞悬液,分6组接种到96孔板,一组为空白对照(只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞),一组为0加药对照组(只有培养基、细胞和CCK-8溶液),其余分别加入1%,2%,3%,4%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24,48,72,96 h后使用CCK-8法测定吸光度,计算细胞活力并观察每一组颜色变化。结果与结论:0加药对照组颜色最深,亚甲蓝各浓度组随着亚甲蓝浓度升高浓度变浅,细胞活力0加药组活力最强,随着亚甲蓝浓度增高,活力下降。推测亚甲蓝对人髓核细胞具有一定的细胞毒性。

基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征

背景:腰突颗粒是课题组治疗腰椎间盘退行性疾病的经验方,一直有较好的临床疗效,但其作用机制一直未明确。目的:基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨临床经验方腰突颗粒防治腰椎间盘退变的可能分子机制。方法:将10只新西兰大白兔按随机数字表随机分为生理盐水组和腰突颗粒组(n=5),生理盐水组予以生理盐水20 mL/次灌胃,腰突颗粒组予以灌服腰突颗粒水煎剂20 mL/次,均2次/d,连续灌胃1周。于最后一次灌胃完成2 h后经颈总动脉采血收集兔血清分别制作为10%DMEM培养液;分别使用2种血清培养液培养人髓核细胞,镜下观察2组细胞形态,锥虫蓝染色后测定2组细胞活力;另取第3代髓核细胞,干预48 h后采用RNA-Seq技术对2组细胞中的mR NA进行检测,进行转录组测序筛选差异mR NA;将得到测序结果进行差异基因表达、GO功能显著性富集及Pathway显著性富集分析。结果与结论:(1)腰突颗粒组髓核细胞贴壁后以圆形或梭形多见,胞浆充足,胞核清晰。细胞核核表面光滑,核膜完整,长条状粗面内质网排列整齐,线粒体少,胞质内可见散在溶酶体及纤丝;生理盐水组细胞呈梭形和多角形,细胞核大,核仁多为2或3个,细胞核表面稍粗糙且质网可见轻微扩张,线粒体少且有部分膜不完整;(2)腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均优于生理盐水组(P<0.05);(3)比较2组测序结果发现,差异表达基因共有464个,其中上调基因有143个,下调基因有321个。差异基因的GO功能显著性富集分析显示,差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程中。差异基因的Pathway显著性富集分析结果发现,主要集中在代谢相关通路;(4)综上,通过RNA-Seq技术获得了腰突颗粒防治椎间盘退变作用的差异基因表达谱,腰突颗粒防治椎间盘退变的分子机制主要通过调节上调细胞外基质代谢相关基因及下调多糖合成相关基因实现,可为进一步研究提供基础。

CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性

背景:前期细胞实验研究发现亚甲蓝确实对人髓核细胞具有毒性作用,且与药物浓度呈正相关,但是其毒性的临界范围未进行研究。目的:使用CCK-8法定量测定亚甲蓝对髓核细胞毒性作用的临界范围值。方法:选取1例椎间盘突出症患者的术后废弃髓核组织,提取髓核细胞,培养1代后制作细胞悬液,分9组接种到96孔板,空白对照只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞;0加药对照组只有培养基、细胞和CCK-8溶液;其余7个加药组分别加入1%,0.5%,0.1%,0.05%,0.01%,0.005%,0.001%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24,48,72,96 h后使用CCK-8法测定吸光度,计算细胞活力并观察每一组颜色变化。结果与结论:(1)颜色变化:0加药对照组颜色最深,加药组颜色与药物浓度负相关,且0.05%、0.01%、0.005%、0.001%组颜色较深并与0加药组颜色接近;(2)各组吸光度值均数及细胞活力:与0加药组相比,1%组吸光度减小(P<0.05),1%与0.5%组比较差异均无显著性意义(P>0.05),0.1%组吸光度及细胞活力显著高于0.5%组,0.05%组显著高于0.1%组;(3)结论:亚甲蓝对人髓核细胞具有细胞毒性,毒性临界值在0.1%-0.05%之间且靠近0.05%,确切值还有待于进一步研究。