脐血单个核细胞成功培养的相关影响因素

目的:脐血来源丰富且免疫原性低,移植后排斥反应低的特性决定其具有临床应用的可行性。实验拟验证脐血单个核细胞数量与孕妇年龄条件、脐血量及制备因素的相关性,并证实其在体外培养的最佳条件。方法:实验于2006-03/2007-01在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。①实验材料:300份脐血均来源于足月分娩的健康孕妇,全部签署知情同意书。孕妇年龄20～35岁,其中≤25岁36例,>25岁264例;脐血采集量15～130mL,其中<33mL18例,≥33mL282例;采集到制备时间差为2～24h,其中>12h30例,≤12h270例。红细胞裂解液由本实验室自制,主要成分为高渗盐水和三蒸水。②实验方法:人脐血用枸橼酸钠抗凝,采用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞,锥虫蓝染色结果表明活细胞比率达95%～100%。将脐血单个核细胞分别按1×106,5×106,1×107的密度接种,以未加细胞因子作为对照组,在无血清DMEM/F12培养液中加入20μg/L神经生长因子和2%神经营养因子B27作为扩增诱导组,于培养后的1,3,7d进行换液,培养周期选择5d、7～10d和15d。③实验评估:分别对脐血单个核细胞数与孕妇年龄、脐血采集量、采集到制备时间差的相关性进行分析。倒置荧光显微镜下观察细胞形态、细胞因子作用及最佳的种植密度、首次换液时间、培养周期。观察使用红细胞裂解液后对脐血单个核细胞增殖和分化的影响。结果:①脐血细胞的生长及形态特征:脐血单个核细胞刚接种时为散在的圆形细胞,2d贴壁,为散在的单个或数个细胞,呈长梭形,形态均一。3d左右细胞突起增加,细胞数量增多。随着培养时间的延长,可见多个细胞之间形成网络,诱导后出现神经样细胞形态。②脐血单个核细胞数的影响因素:脐血单个核细胞数与孕妇年龄不相关(r<0.3),与脐血量、采集到制备时间差均具有相关性(r>0.8)。③脐血单个核细胞培养影响因素:种植密度为5×106L-1、首次换液时间在3d左右、培养周期为7～10d的细胞生长状态较好。扩增诱导组脐血单个核细胞增殖和分化状态好于对照组。④红细胞对脐血单个核细胞生长分化的影响:红细胞裂解的最佳时间为45～50s,并发现红细胞对脐血单个核细胞的生长有一定程度影响,且破骨细胞较多。红细胞裂解后的脐血单个核细胞增殖分化较好,细胞形态较为均一。结论:①采集量为33mL、且采集到制备的时间差为12h的脐血制备单个核细胞数量超过1×108的成功例数较高。②5×106L-1接种密度、首次换液时间为3d、培养周期7～10d的脐血单个核细胞生长状态较好,神经细胞生长因子可促进其增殖分化。③红细胞裂解后脐血单个核细胞增殖分化更好,破骨细胞较少。