靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的构建靶向小鼠S1PR3基因的sh RNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照sh RNA设计原则,合成对应的sh RNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将sh RNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。

循环肿瘤细胞在监测肿瘤转移中的应用

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)指由实体瘤或转移灶释放进入外周血液循环的肿瘤细胞,是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因。随着对肿瘤转移机制的深入研究,尤其是伴随现代检测技术的不断改进,CTCs的检测取得一些突破性的进展。CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具,在早期发现是否复发与转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点。但目前的研究处于发展阶段,面临着许多亟待解决的问题。本文就循环肿瘤细胞的基本概况,检测方法,临床研究进展及存在的主要问题作一综述。

外周血液样本抗凝剂类型、保存时间和温度对CIK细胞培养的影响

目的探讨外周血液样本抗凝剂类型、保存时间和保存温度对细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞培养的影响,为自体免疫细胞治疗技术的外周血保存标准化提供实验依据。方法将抽取的4份60 m L外周血样本分别应用肝素钠、细胞保存液（枸橼酸钠）和EDTA抗凝剂抗凝,并分别存放于4、22、30℃的环境中,储存0、4、8、24 h,应用正交实验设计优选为12组,然后分离出单个核细胞分别诱导培养成CIK细胞,对比12组CIK细胞增殖效率及γ干扰素（IFN-γ）分泌量的变化。结果在CIK细胞培养过程中,EDTA组CIK细胞增殖不明显,肝素钠组和血液保存液组CIK细胞增殖明显,且肝素钠优于血液保存液;血液保存时间对CIK细胞培养影响不明显,但保存时间越长,细胞增殖效率越差,保存时间超过8 h的CIK细胞,其增殖效率在第16天以后明显降低。对培养时间在16 d内的CIK细胞,血液保存温度影响不显著,但CIK细胞培养16 d之后,22℃保存条件下,CIK细胞增殖效率最高,4℃次之,30℃最差。结论肝素钠和血液保存液均可用于CIK细胞培养的血液抗凝;保存时间在24 h内,温度在4℃~30℃之间保存的血液,均可用于CIK细胞培养。

TLR7激动剂增强人CIK细胞杀伤功能的研究

目的研究Toll样受体7（toll-like receptors 7,TLR7）激动剂（Tlr7a）对人细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkiller cell,CIK）杀瘤效果的影响。方法采集3名健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,按照常规CIK细胞培养（Control组）或day0额外添加Tlr7a（Tlr7a组）2种方案培养2周。采用细胞计数法检测细胞的增殖效率,流式细胞术检测细胞亚群的比例,CCK-8比色法检测CIK细胞对人红白血病细胞（K562细胞）的杀伤活性。结果与对照比,Tlr7a处理后,总细胞中主要效应细胞CD3^＋CD56^＋双阳细胞占比增加4.1%,分别为（11.9±2.9）%和（16.0±5.8）%。杀伤实验结果显示,当E∶T为20∶1时,2组细胞对K562杀伤率分别为（98.8±4.2）%和（74.4±12.3）%。相比于Control组,Tlr7a组的细胞杀伤功能明显增强（P〈0.05）。结论 TLR7激动剂（Tlr7a）具有增强CIK效应细胞的扩增能力,其刺激后获得的CIK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤效果更好。

Calcein-AM/PI双染法结合流式细胞术检测γδT细胞毒性的方法

目的建立和优化钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染法结合流式细胞术检测γδT细胞细胞毒活性的方法。方法利用Calcein-AM标记靶细胞,然后与效应细胞共孵育24 h,结束后加入PI,最后流式细胞术检测;通过BD公司绝对细胞计数管验证上述流程的稳定性和可靠性。结果 Calcein-AM能在较低浓度（0.1～0.5μmol/L）下对靶细胞在宽密度范围（0.1～10）×10^6/ml内进行很好标记,而且24 h内对细胞活率无影响,同时还能与未标记细胞进行很好的区分;整个流程具有很好的稳定性和可靠性。结论建立并优化了Calcein-AM/PI双染法结合流式细胞术检测γδT细胞细胞毒效应的方法,本方法除操作简单、重复性好、灵敏度高外,还能更好的区分死亡细胞的来源。

TLR7激动剂替代IFN-γ诱导CIK细胞杀伤肿瘤的研究

目的:探讨TLR7激动剂(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN-γ体外培养细胞因子诱导杀伤性细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗肿瘤的免疫效应。方法:分离健康人外周血单个核细胞,在体外诱导CIK。分两组:CIK组和Tlr7a-CIK组。对各组分别进行免疫杀伤性研究,检测细胞免疫表型并分析对K562肿瘤细胞的杀伤活性。结果:CD56+细胞在Tlr7a-CIK组显著增加(P<0.05),Tlr7a-CIK组杀伤活性较CIK组显著增强(P<0.05)。结论:Tlr7a可以替代IFN-γ促进CIK细胞杀伤肿瘤。

2种细胞冻存液对脐血单个核细胞冻存质量的影响

目的:探讨2种细胞冻存液对脐血来源单个核细胞冻存质量的影响,为脐血来源单个核细胞的冻存提供合适的冻存方法和理论依据。方法:采用细胞计数仪检测不同冻存液(冻存液1:培养基∶自体血浆∶DMSO=5∶4∶1;冻存液2:自体血浆∶DMSO=9∶1)对脐血单个核细胞复苏后回收总数的影响;同时使用流式细胞仪和体外造血细胞培养术分析脐血细胞损失的类群和脐血造血分化的能力。结果:细胞计数仪和台盼蓝拒染实验发现,冻存液2细胞总回收率为(72.88±12.24)%,显著高于冻存液1的细胞总回收率(56.65±9.34)%;流式结果也表明,冻存液1的CD34+造血干细胞损失率高达(35.90±2.56)%,其他CD14+单核/中性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD3-CD56+NK细胞损失率分别为(49.95±3.68)%、(24.21±2.35)%、(33.87±3.21)%和(35.18±3.52)%;而冻存液2的细胞除了CD4+T细胞和CD8+T细胞损失率分别为(13.50±1.25)%和(24.67±3.72)%,其他细胞比例都相应增加。同时,集落形成能力检测结果显示,冻存液2的CFU-GM和BFU-E的集落团多于冻存液1的细胞。结论:自体血浆∶DMSO=9∶1的冻存液对脐血单个核细胞冻存效果较好。

肿瘤特异性γ δ T细胞扩增体系的建立及其抗肿瘤活性研究

目的:建立一种体外诱导肿瘤细胞特异性γδ T细胞的培养体系。方法:从人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),用不同浓度的磷酸抗原(IPP)与rhIL-2联合刺激γδ T细胞增殖,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后CD3^+Vγ9^+的γδ T细胞数量以及比例,并计算其扩增效率。结果:经15天扩增培养后,高浓度组10μg/ml的IPP联合500IU/ml rhIL-2刺激得到的γδ T细胞的扩增效率最高,且扩增培养至第9天的γδ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性。结论:适宜浓度磷酸抗原(IPP)联合rhIL-2能有效体外诱导具有较强抗肿瘤活性γδ T细胞的扩增。

Immune Cell SR对冻存PBMNC诱导培养CIK的效果研究

目的:探讨Immune Cell SR(血清替代物)在冻存复苏后PBMNC诱导CIK细胞培养过程中的效果,为免疫细胞的工业化生产提供一个新的策略。方法:提取健康志愿者外周血单个核细胞,经短期冻存后复苏并诱导培养CIK细胞,采用台盼蓝拒染法检测细胞活率,流式细胞术分析免疫细胞亚群,并用Calcein-AM/PI双染法检测其杀伤活性;结果:冻存后PBMNC中在对照组未能正常扩增,与新鲜组相比,2%SR组细胞扩增倍数较低,且差异显著(P<0.05),5%SR组、10%AP组与新鲜组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);冻存前后CD3^+、CD3^+CD8^+、CD3^+ CD56^+细胞亚群比较均无明显差异(P>0.05);细胞培养后,各组间CD3^+、CD3^+CD4^+、CD3^+CD8+、CD3^+CD56^+、CD3^-CD56^+亚群及体外杀伤活性比较均无明显差异(P>0.05);结论:采用5%SR替代自体血浆可以很好地诱导冻存的PBMNC培养CIK细胞,且无外源性蛋白,安全可靠,为免疫细胞冻存技术在细胞治疗中的应用提供条件。

人乳头瘤状病毒感染与机体免疫的研究进展

人乳头瘤状病毒（human papilloma virus,HPV）是一类高度异质性的双链环状小分子DNA病毒,具有严格的嗜上皮特性,其整个生活周期都局限在上皮层,主要感染人类皮肤和黏膜,并引起相应部位上皮组织的增生性病变[1]。HPV在女性人群中感染率极高,