开放重点实验室,培养学生实践能力和创新能力

以组织本科学生参加“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛为契机，改革重点实验室管理模式，面向本科学生开放，开展科研创新实验，培养学生实践能力、创新能力和科研素质，促进实践教学改革的情况和基本经验。

非生物胁迫因子对大豆Sali3-2基因的调控作用

通过生物信息学方法对Sali3-2基因上游非编码区序列(-1 945/+1)中的顺式作用元件进行预测.发现该序列中存在铜响应元件、干旱胁迫响应元件及与低温等非生物胁迫相关元件等.在不同非生物胁迫条件下,分别对转基因烟草悬浮细胞和转基因拟南芥幼苗中Sali3-2启动子片段驱动报告基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,Gus)的表达进行分析.结果表明,在转基因烟草细胞和拟南芥幼苗中,Gus基因的表达明显受Al3+胁迫的诱导和Cu2+过多的抑制;在转基因烟草细胞中,该基因的表达一定程度上受脱落酸、渗透胁迫和盐胁迫的诱导,研究结果为了解Sali3-2基因的功能及调控作用奠定了基础.

血红蛋白基因在产CBHⅡ毕赤酵母工程菌中的表达

目的:提高毕赤酵母工程菌P.pastoris-CBHⅡ液体发酵产纤维二糖水解酶(CBHⅡ)的能力。方法:分别构建了用于胞外及胞内表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-vhb与pPICZαA(-s)-vhb。通过电转化将两种质粒转化巴氏毕赤酵母重组菌体P.pastoris-CBHⅡ菌株,经过筛选分别获得可正确表达具有生物活性的VHb蛋白的重组菌株P.pastoris-CBHⅡ-vhb(胞内表达VHb)及P.pastoris-CBHⅡ-vhb(-s)(胞外表达VHb)。结果:摇瓶发酵实验表明,血红蛋白在贫氧条件下可促进CBHⅡ的分泌表达,培养液上清的CMC酶活分别从出发菌株P.pastoris-CBHⅡ的1.81U/ml提高到2.04U/ml(胞内表达VHb)与1.93U/ml(胞外表达VHb)。VHb蛋白胞内表达菌株比胞外表达菌株效果更明显。

丝状真菌Podospora anserina AA11家族裂解多糖单加氧酶基因的鉴定和功能研究

辅助活性蛋白家族(auxiliary activity family,AA family)中的裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)能催化纤维素、几丁质和淀粉等多种难降解碳水化合物的氧化解聚。尽管目前对LPMO的酶学研究较多,但对LPMO基因失活的研究却鲜有报道。本研究利用同源重组方法定点敲除丝状真菌Podospora anserina中AA11家族的5个LPMO基因PaLPMO11A(Pa_4_4790)、PaLPMO11B(Pa_1_5310)、PaLPMO11C(Pa_2_7840)、PaLPMO11D(Pa_2_8610)和PaLPMO11E(Pa_3_9420),分别构建了单突变体ΔPaLPMO11A(ΔA)、ΔPaLPMO11B(ΔB)、ΔPaLPMO11C(ΔC)、ΔPaLPMO11D(ΔD)和ΔPaLPMO11E(ΔE),然后通过遗传杂交构建所有多基因突变体。通过在不同碳源培养基上的表型分析、DAB和NBT染色以及纤维素酶活测定分析野生型菌株与突变型菌株在生长速率、有性生殖、氧化应激和纤维素降解能力等方面的差异,揭示LPMO11基因在P.anserina菌株的生长发育和木质纤维素降解过程中的作用。实验结果表明,在不同纤维素碳源上,ΔBΔCΔE、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE突变型菌株的有性生殖能力降低,其余突变型菌株的孢子萌发效率、生长速率和生殖能力几乎没有差异。PaLPMO11家族5个基因的同时缺失,会导致菌株利用各种碳源的能力明显降低、生长速率降低、孢子萌发率降低、子实体数减少、部分子实体发育异常、寿命缩短和降解纤维素的能力显著下降,但仍有野生型45%以上的总纤维素酶活力。上述结果表明,LPMO11基因可能参与P.anserina的生长发育、有性生殖、衰老和纤维素降解过程。本研究为系统阐述丝状真菌P.anserina中木质纤维素降解的调控机制提供参考。

大豆耐盐相关基因的分离及其功能鉴定

利用大肠杆菌功能表达体系,从大豆开花40d未成熟种子的cDNA表达文库中筛选获得了11个耐盐相关cDNA克隆.对其中3个克隆的插入片段进行测序.结果显示,其中的Gm1013为一尚未报道的新基因片段;GmRPS25 2编码的蛋白质序列与西红柿40S核糖体蛋白S25有91%的同源性;GmAIP 2编码的蛋白质序列与大豆根铝诱导蛋白SALI3 2有97%的同源性.其中GmAIP 2可表达分子量为30 8kD的多肽.pET GmAIP 2转化后的大肠杆菌在含800mmol/LNaCl和700mmol/LKCl的液体培养基中生长状况明显好于对照菌,即前者表现出较短的生长迟滞期和较高的生长量.

四逆汤中脂类生物碱来源于酯交换反应的研究

目的研究附子中脂类生物碱(脂碱)的溶解性,确定四逆汤中脂碱的来源。方法利用电喷雾离子阱质谱分析比较生附子、四逆汤、煎煮后生附子药渣、生附子与半夏共煎液中的生物碱。结果在四逆汤中检测到少量脂碱,在生附子与半夏共煎液中未检测到脂碱,脂碱成为煎煮过生附子中的主要生物碱。结论脂碱在加热条件下也不溶于水,在四逆汤中检测到的脂碱来源于双酯型生物碱的酯交换反应。

钌(II)多吡啶配合物光断裂DNA的实验研究

研究了一系列钌(II)多吡啶配合物对pBR322DNA的光断裂作用,并与光谱法和粘度法的研究结果进行了对比.实验结果表明,钌(II)多吡啶配合物光断裂DNA的能力不仅与配合物与DNA相互作用的结合模式和结合强度有关,还与配合物自身的电子结构有关;钌(II)多吡啶配合物对DNA的光断裂存在立体选择性;其断裂机理是激发态的配合物与溶液中的氧分子发生能量转移生成单线态氧活性氧化物种,将鸟嘌呤碱基氧化而导致DNA断裂.本研究对于遗传工程中的化学核酸酶以及以DNA为靶标的药物设计有重要的意义.

草乌花煎煮过程中三酯型乌头生物碱的酯交换反应

目的研究草乌花煎煮过程中脂类生物碱的变化。方法利用电喷雾离子阱质谱分析,比较草乌花乙醇提取液、草乌花单煎液和草乌花煎煮后残渣中的生物碱。结果在草乌花单煎液中易溶于水的别那宁质量分数显著提高,未检测到脂肪酸酯型生物碱,三酯型脂类生物碱成为煎煮过草乌花中的主要生物碱。结论在草乌花煎煮过程中,双酯型和三酯型乌头生物碱除发生水解反应外,还发生酯交换反应生成双酯型和三酯型脂类生物碱。三酯型乌头生物碱的C8位乙酰基被各种长链脂肪酰基取代的酯交换反应为首次报道。

水稻高效再生体系的建立及其对大豆Em基因的转化

以粳稻丰达1号成熟胚为外植体,建立了适合水稻转化的高效再生体系,通过农杆菌介导法将大豆Em基因转化水稻.结果表明:以NMB+500 mg·L-1脯氨酸+250 mg·L-1谷氨酰氨+300 mg·L-1水解酪蛋白+2 mg·L-12,4-D为作诱导培养基诱导愈伤组织,其诱导率为97%;愈伤组织分化率为65%;农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,获得了26株再生植株;随机选取其中4株候选转基因水稻幼苗进行PCR筛选,初步证明大豆Em基因已整合到水稻基因组DNA中;RT-PCR检测结果表明,转入的外源大豆Em基因在转基因水稻中得以表达.本实验成功地建立了适合水稻转化的高效再生体系,为通过基因工程技术培育水稻新品种奠定了基础.

磁场治疗对实验动物体内钙分布的影响

目的:观察磁场对实验动物钙分布的影响,为磁场治疗骨质疏松提供有力的新证据。方法:实验于2005-01/06在深圳大学生命科学学院微生物基因工程深圳市重点实验室与南方医科大学公共卫生与热带医学学院军事预防医学重点实验室完成。①40只雌性SD大鼠分为4组,每组10只,切除大鼠卵巢建立骨质疏松模型,假手术组仅切除卵巢附近少量脂肪;去卵巢组卵巢切除后不进行曝磁处理;去卵巢+磁场组卵巢切除后曝磁;去卵巢+钙+磁场组卵巢切除后曝磁,并给予补钙。曝磁时间共30d。②普通雌性家兔随机分为3组,每组5只,磁场未处理组、2h后磁场处理组、同步磁场处理组。1个月后感应耦合等离子体发射光谱仪检测大鼠骨钙含量、液体闪烁计数仪测量雌激素和骨钙素变化。并进一步明确磁场对体内摄入钙分布影响,利用钙的同族元素锶和钙在生物体内代谢过程极为相似的特点,使用放射性核素锶-85示踪技术动态观察磁场处理后锶-85在实验普通家兔血液、骨骼、尿液和粪便中的存留情况,间接推论磁场对钙在体内代谢的影响。结果:实验大鼠和兔全部进入结果分析。①磁场处理可以促进骨钙含量增加犤去卵巢+钙+磁场组骨钙含量达(0.226±0.015)g/g,而去卵巢组为(0.204±0.013)g/g,F=13.14,P<0.05犦。②磁场处理不影响血清雌激素和骨钙素含量犤去卵巢+钙+磁场组为(5.1±2.1)ng/L,去卵巢组(4.0±1.3)ng/L,F=4.58,P>0.05犦。③磁场处理减少锶-85在血、尿和粪便中的停留,促进其在骨组织中的沉积,并抑制其自骨骼向骨外的转移。结论:磁场有促进血液中钙沉积到骨组织,抑制其从骨骼中丢失的作用,这也是磁场改善骨质疏松的机制之一。

丙酮丁醇梭菌代谢工程菌的构建及其发酵性能

丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum可以利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖等多种底物,发酵糖获得丙酮、丁醇、乙醇等产物,是一种优良的木质纤维素同步糖化发酵菌种。为获得具有更优良发酵性能的木质纤维素发酵菌株,使用代谢工程技术对丙酮丁醇梭菌进行改造。将乙酰乙酰CoA硫解酶基因(thl)的启动子和末端两个同源片段以及醛/醇脱氢酶基因(adhE)的开放阅读框连接到pUC18上,构建成整合型质粒pTAEE,电转化丙酮丁醇梭菌后在红霉素抗性平板筛选转化子。通过PCR扩增及产物序列分析表明,质粒pTAEE中的adhE基因以单交换的方式整合到转化子基因组中,增强adhE的表达。重组菌T4的乙醇得率为2.3%,比野生菌提高了15%,乙醇浓度为0.39 g/L,与野生菌相当;丁醇得率为41.6%,比野生菌提高了69%,丁醇浓度为6.9g/L,比野生菌提高了41%,获得了发酵性能更高的丙酮丁醇梭菌代谢工程菌株。

细胞质处理小体(P-小体)与基因表达的调控

m RNA处理小体,又称P-小体(processing bodies,P-bodies),是细胞质中含有多种功能蛋白和RNA的聚集体.评述P-小体的形成和运动特点,以及其与小RNA、外切体相互作用,参与基因表达的调控.介绍了本实验室在P-小体植物细胞中的最新研究进展.指出P-小体是m RNA降解和储存的场所,在转录后水平参与基因表达的调控,P-小体在细胞中是动态变化的,P-小体中多样化的功能蛋白在P-小体的组装、功能行使中发挥重要作用.P-小体作为细胞质内m RNA的储存和降解结构在基因表达的转录后调控中起重要作用,其调控机制尚待进一步研究补充,P-小体与小RNA分子(micro RNA,mi RNA)调控的基因沉默之间也存在关联性.

植物凝集素SMLII基因启动子的克隆及序列分析

根据已克隆的丹参植物凝集素SMLII基因cDNA序列,利用染色体步移技术克隆出SMLII启动子区序列,并进行生物信息学预测分析该基因的功能,结果得到了该基因上游1 023 bp的启动子序列(GenBank Accession No:KF193867)。分析表明,在该序列中不但含有真核生物典型的核心启动子区TATA-box、CAAT-box,而且含有一些特有的上游启动子元件ABRE、ARE、ASF1MOTIFCAMV、HSE、IBOXCORE、WBOXATNPR1等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件。

拟南芥AGO基因家族分析及盐胁迫下的表达验证

argonaute(AGO)蛋白家族成员在小核糖核酸(RNA)介导的转录后调控中有重要作用.通过拟南芥AGO蛋白家族的结构域及各类植物中的AGO蛋白的进化关系进行分析,发现AGO蛋白在植物中结构和进化相对保守.根据已有的芯片数据,对拟南芥中AGO蛋白家族的组织表达进行分析,发现某些AGO基因具有组织表达的特异性.进一步通过基因上游启动子响应元件分析,以及盐等胁迫下的芯片和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验数据分析,发现AGO2、AGO3和AGO7等基因受到盐等非生物胁迫的诱导表达.初步探明了拟南芥中AGO基因家族在盐胁迫下的差异表达规律.

采用酵母双杂交法筛选PSRPK相关蛋白基因

本课题组在前期研究中,从多头绒泡菌中分离到一个SR蛋白激酶基因psrpk,并将其编码蛋白命名为PSRPK(SR protein kinase ofPhysarum Polycephalum).为分离PSRPK相关蛋白基因以了解PSRPK的功能,构建了转化率为2×106转化子/3μg pGADT7-Rec、密度为5.35×108cells/mL、滴度为2.34×109cfu/mL的多头绒泡菌酵母双杂交AD库.以PSRPK为饵蛋白筛选该文库得到接合率为41.18%的杂交酵母,在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-H is培养板上筛选获得1476个杂交克隆,其中,X-gal滤纸显色呈强蓝色的克隆有342个.对大于500 bp的67个克隆测序获得35个cDNA片段,其中编码Plasm in C、branched-chain am inoacid am inotransferase(BCAT)类似蛋白、MSF1类似蛋白、m ixed-linked glucanase precursor类似蛋白、FCY1p类似蛋白和40S ribosomal protein S2类似蛋白等7个cDNA片段在阳性杂交酵母克隆中出现多次,其余仅出现一次.在35个cDNA片段的编码序列中有15个具有同源蛋白,31个编码序列的丝氨酸含量大于或等于6%,符合激酶底物的组成特征.

雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR技术,从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis 34-1n)总RNA中扩增出β-胡萝卜素羟化酶基因cDNA序列,将此序列亚克隆于pMD 18-T simple Vector上,经过序列测定,表明该基因的开放阅读框为879bp,编码292个氨基酸,与雨生红球藻(H. pluvialis Flotow NIES-144)β-胡萝卜素羟化酶基因氨基酸序列相比,其在编码氨基酸的第33位有一个氨基酸的缺失。在15、314、9和56位上的氨基酸也存在差异。多序列比对分析表明,雨生红球藻与莱茵衣藻的亲缘关系较近,与其他高等植物以及细菌的亲缘关系相对较远。

CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达

重构基因cbh2-linker-CDeg4表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶CBH II和内切葡聚糖酶EG IV 2种催化活性,在纤维素降解等方面有着重要应用。本研究通过overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶(PDC)的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、重构基因cbh2-linker-CDeg4和pdc终止子依次连接,以质粒p PICZαA为基本骨架,构建表达载体p PIC-PCT。采用原生质体转化法将p PIC-PCT和含潮霉素抗性筛选标记的质粒p AN7-1共转里氏木霉。SDS-PAGE分析表明,重构基因cbh2-linker-CDeg4实现了在里氏木霉中的组成型表达,测得重组木霉发酵上清液的CMCNa酶活最高达到4.08 U/m L,是出发菌株的5.55倍,FPA酶活达到0.915 U/m L,较出发菌株提高了43.6%。酶学性质初步研究表明:粗酶液的最适p H为5.0,最适温度为50℃。

锌指蛋白在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中的研究进展

简要介绍了C2H2型、C4型和C6型三类锌指蛋白,分别从三类锌指蛋白总结了其在丝状真菌纤维素酶基因表达调控中发挥的作用,举例分析了锌指蛋白在纤维二糖水解酶Ⅰ和纤维二糖水解酶Ⅱ编码基因上表达调控的过程,结合相关研究总结了锌指蛋白在丝状真菌产纤维素酶中应用,最后指出通过该方面研究将有助于在分子水平上揭示纤维素酶表达调控的机理,为高效率、低成本生产纤维素酶奠定基础。

阿尔茨海默病转基因小鼠肝内核受体和细胞色素氧化酶基因转录谱变化

目的探讨阿尔茨海默病(AD)病变与肝Ⅰ相药酶基因表达的相关性,为早期和长期药物干预AD病程提供实验参考。方法制备B6.129-PS1M146V/APPSwe/Tau P301L三重转基因AD模型小鼠(3×Tg AD小鼠)及同系非转基因正常小鼠(NTg小鼠)肝组织总RNA和总蛋白质样品,逆转录PCR/实时荧光定量PCR技术检测肝核因子4(HNF4)等7种核受体和细胞色素氧化酶P4501a2(Cyp1a2)等7种CYP基因mRNA相对表达量,比较基因转录谱差异;Western蛋白印迹法检测技术检测差异显著的目的基因蛋白质水平。结果与NTg小鼠相比,3×Tg AD小鼠HNF4、雌激素受体(ERα)及组成型雄甾烷受体均下调近66%(P<0.01),孕烷X受体和芳香烃受体分别上调1.84和1.64倍(P<0.05),糖皮质激素受体及受氧化应激激活的核因子E2相关因子未见显著变化;主要药物代谢酶Cyp2b10及Cyp2a5 mRNA分别降低至正常小鼠水平的3%(即下降97%,P<0.01)和30%(P<0.05),Cyp2e1、Cyp2j9、Cyp3a11基因的转录水平则分别上调了2.26倍、2.42倍和3.66倍(P<0.05);Cyp1a2和Cyp2d22基因转录在两种小鼠中无明显差异。Western蛋白印迹分析证实,3×Tg AD小鼠ERα和CYP2a5明显下降(P<0.05)而Cyp3a11表达则明显上升(P<0.05),蛋白质表达变化的趋势与其相应mRNA水平改变一致。结论 3×Tg AD小鼠肝内核受体基因及CYP酶基因转录谱发生显著改变,提示AD病变可能干扰机体肝代谢功能,对机体内源性及外源性化合物生物转运产生影响。

丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因

报道了在里氏木霉中建立的一种以红色荧光蛋白(DsRed)为报告基因的RNA干扰方法。首先,将构建的表达DsRed质粒p ANRed1转化里氏木霉QM9414,得到抗潮霉素B抗性并能稳定表达DsRed的菌株DsRed-T.reesei。其次,以丙酮酸脱氢酶启动子Ppdc和纤维二糖水解酶I终止子cbh I为原件,克隆到载体p PHL上构建质粒p PHL-Ppdc-Tcbh1。根据DsRed基因序列设计特定的siRNA干扰序列和另一条无同源序列的siRNA作为阴性对照,克隆到载体p PHL-Ppdc-Tcbh1得到重组质粒。将其转化到DsRed-T.reesei中,用含有100μg/m L潮霉素B和250μg/m L腐草霉素的PDA平板筛选转化子。结果表明,约79%的转化子出现红色荧光沉默现象,其中一些转化子DsRed的表达几乎完全被抑制。荧光定量PCR和Western印迹分析显示DsRed基因的表达受到不同程度的下调。以上结果提示,在里氏木霉中可用此方法研究基因表达调控。