基于HLA组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型

背景:传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的:分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法:对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。结果与结论:(1)2例模棱两可分型结果分别为A*02∶03∶01及C*07:02∶01∶01杂合新等位基因;(2)A*02∶03∶01杂合新等位基因与A*11∶01∶01∶01全长比较,在NT817由C发生突变为T;(3)C*07∶02∶01∶01杂合新等位基因与C*08∶01∶01比较,在NT879由A发生突变为G;(4)结果表明,以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于组特异性单倍体全长测序分型方法能准确定型HLA基因分型模棱两可结果并发现新等位基因。

EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制

目的研制一种能同时检测EV71，CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要用于EV71，CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针，优化实时荧光定量PCR检测体系，并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围；同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒，线性范围在5＊10^2 copies／μl-10^5 copies／μl，该范围内检测结果良好；优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0．48，0．24μmol／L，EV71上下游引物和探针浓度分别为0.40，0．20μmol／L。敏感度达到500copies／μl，重复性变异系数CV≤5％；该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强，在-20℃下可以保存一年，对EV71，CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品，阳性检出率为100％（20／20），阴性检出率为100％（6／6）。结论试验建立的EV71，CA16肠道病毒实时荧光定量RT—PCR检测方法可用于EV71，CA16肠道病毒的临床诊断。

靶向MUC1肿瘤治疗性疫苗的制备和功能研究

目的制备一种能高效激活免疫细胞的肿瘤疫苗,提高免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功能。方法同源重组表达含人免疫球蛋白（Ig G）Fc片段的MUC1蛋白作为抗原,并利用DOTAP阳离子脂质体包被抗原呈递给体外诱导培养的树突状细胞（DC）,然后用DC细胞激活产生特异性免疫应答的T细胞,检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。结果成功构建含人免疫球蛋白（Ig G）Fc片段的MUC1蛋白表达载体,经大肠杆菌成功表达目的蛋白并纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白条带。抗原蛋白经DOTAP阳离子脂质体包被,包封率达到97%。包被后的抗原刺激体外培养的免疫细胞,流式细胞术检测发现1~40μg/ml抗原制剂均能有效激活产生免疫应答,并显著增加功能性肿瘤杀伤细胞亚群比例,联合对肿瘤细胞（MCF-7）杀伤功能分析实验,10μg/ml疫苗制剂效果最佳,能提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤率45%以上。结论制备的疫苗制剂能有效被DC细胞捕获,并激活产生特异性应答的功能性肿瘤杀伤细胞,显著提高了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。

PLGA纳米颗粒偶联的双特异性抗体制备及功能研究

目的制备一种能提高T细胞对癌细胞杀伤能力的双特异性抗体。方法利用生物可降解材料PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)制备成纳米颗粒,然后利用化学方法在纳米颗粒表面偶联能靶向结合T细胞的CD3抗体和癌细胞标志物MUC1的抗体,利用T细胞对癌细胞的杀伤实验来检测其功能。结果成功制备出直径200 nm的PLGA纳米颗粒并偶联上CD3和MUC1抗体,功能检测得出制备的双特异性抗体能显著提高T细胞对癌细胞的杀伤率。结论制备出一种能显著提高T细胞对癌细胞杀伤率的双特异性抗体。

禽流感病毒H7N9型实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速准确诊断禽流感病毒 H7N9型的实时荧光定量 RT-PCR检测方法。方法参照国家生物技术信息中心（NCBI）公布的 H7N9基因 HA序列，设计特异性引物及TaqMan探针；构建阳性重组质粒，验证其最低检测拷贝数、重复性及特异度。结果试验构建的阳性重组质粒，线性关系在6＆#215;102 copies／μl～6＆#215;108 copies／μl范围内检测结果良好；用该方法测得最低拷贝数为600 copies／μl，特异度和重复性（CV＜1％）良好，无交叉反应；用该荧光定量 RT-PCR检测方法检测8份阳性样品和8份阴性样品，准确率为100％（16／16）。结论实验建立的实时荧光定量 RT-PCR检测方法可用于禽流感病毒 H7N9型的快速检测。