表达宫颈癌抗原基因的李斯特菌平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的 构建表达宫颈癌抗原的单增和绵羊李斯特菌平衡致死系统,并研究其基本生物学特性,为宫颈癌免疫治疗提供参考数据。方法 将实验室已有的HPV16型E6E7融合蛋白抗原基因盒通过无缝克隆的方式连接到含有营养基因dal的回补质粒pCWgfp-LM dal-Amp上,并用asd营养基因替换回补质粒的氨苄(ampicillin, Amp)抗性基因,转化大肠杆菌受体菌DH5αΔasd,利用营养筛选得到表达宫颈癌抗原同时不具有Amp抗性的回补质粒pCWgfp-E6E7-LM dalAmpfree,将其分别电转两株敲除了毒力基因actA、plcB和营养基因dal、dat的减毒李斯特菌营养缺陷株LMΔdd和LIΔdd中,得到表达宫颈癌抗原基因的单增和绵羊李斯特菌平衡致死系统。观察其体外生长情况,利用蛋白印迹实验检测蛋白表达情况,PCR检测回补质粒pCWgfp-E6E7-LM dal-Ampfree的体外传代稳定性,通过基本生化反应测定和溶血实验研究其基本生物学特性。结果 成功构建表达宫颈癌抗原的两种李斯特菌平衡致死系统;目标蛋白能够在李斯特菌平衡致死系统中成功表达;表达宫颈癌抗原的回补质粒能够在李斯特菌平衡致死系统中稳定存在;表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统较李斯特菌营养缺陷株相比明显恢复生长;生化反应测定结果显示,表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统与李斯特菌减毒株绝大多数生化反应保持一致;添加了宫颈癌抗原基因的李斯特菌平衡系统仍能保持溶血能力,但略逊于未表达宫颈癌抗原的李斯特菌平衡致死系统和李斯特菌减毒株。结论 成功构建表达宫颈癌抗原基因的两种李斯特菌平衡致死系统,其在体外能正常生长,回补质粒能在体外稳定存在,基本生化特性及溶血能力变化不大,可作为宫颈癌治疗性疫苗候选株进一步研究。

壳寡糖的免疫佐剂效果及作为减毒活菌载体疫苗佐剂的可行性探索

目的 探究壳寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)的免疫佐剂效果,包括免疫激活作用和引发溶酶体逃逸作用,并探索其是否可以作为减毒活菌载体疫苗佐剂。方法 (1)以0(对照组)、0.1~4 mg/mL COS培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞24 h,利用CCK8实验检测细胞活力的影响;以0(对照组)、1、2、4 mg/mL COS干预小鼠RAW264.7细胞24 h,通过RT-qPCR实验检测细胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β、TLR-4的mRNA表达水平。(2)RAW264.7细胞加入1 mL含有不同组分[钙黄绿素(Calcein)50μg/mL,COS 2 mg/mL,阻断剂bafilomycin A1 1μmol/mL]的PBS培养,分组为Calcein组、Calcein+COS组、Calcein+COS+Bafilomycin A1组。通过激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞在有或无COS干预下对荧光染料Calcein的吞噬和胞内荧光分布情况,判断COS是否能够引发溶酶体逃逸。(3)用0.5、1、2、4、8 mg/mL COS包被减毒李斯特菌载体宫颈癌治疗性疫苗候选株LM?E6E7和LI?E6E7,测定Zeta电位变化,选择COS成功包被细菌的质量浓度。检测2 mg/mL COS包被LM?E6E7和LI?E6E7前后,RAW264.7细胞对疫苗菌株的吞噬率。结果 (1)CCK8结果显示,与对照组相比,不同质量浓度COS干预RAW264.7细胞24 h后,对细胞无毒性,并能够促进细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR结果表明,与对照组相比,COS干预能够上调RAW264.7细胞TLR-4和IFN-γ的mRNA水平,同时抑制TGF-β和IL-10的mRNA表达水平,以4 mg/mL COS组最为明显(P<0.05)。(2)激光共聚焦显微镜发现在COS干预下,Calcein+COS组比Calcein组有更多的荧光染料从溶酶体内释放进入胞内,而这个过程可以被bafilomycin A1阻断。(3)Zeta电位结果表明COS质量浓度达到2 mg/mL时,能成功包被到细菌表面。疫苗株被COS包被前、后,RAW264.7细胞对LM?E6E7的吞噬率分别为5.70%和22.00%,差异有统计学意义(P<0.05);RAW264.7细胞对LI?E6E7的吞噬率分别为1.55%和6.12%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 COS具有激活巨噬细胞免疫应答和引发溶酶体内物质逃逸溶酶体的作用,包被减毒活菌载体疫苗候选菌株可促进巨噬细胞对细菌的吞噬,可望进一步开发作为细菌载体类疫苗佐剂。

1,8-桉油醇对大肠埃希菌杀灭效果的研究

目的研究1,8-桉油醇对大肠埃希菌的杀灭效果。方法通过悬液定量杀菌试验,计算不同浓度1,8-桉油醇溶液对悬液内大肠埃希菌的杀灭对数值,评价其杀灭效果。结果5000 mg/L的1,8-桉油醇溶液对悬液内大肠埃希菌作用5 min,平均杀灭对数值>5.00;4000 mg/L的1,8-桉油醇溶液对悬液内大肠埃希菌作用20 min,平均杀灭对数值>5.00。结论1,8-桉油醇对大肠埃希菌具有良好的杀灭效果,可作为一种植物源消毒剂成分进行开发研究。