淡色库蚊性别差异表达cDNA文库的构建和分析

目的为探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用,建立传播疾病的淡色库蚊性别差异表达cDNA文库,从而筛选阻断疾病传播的疫苗候选分子。方法以淡色库蚊雌蚊成蚊为检测方(Tester)、雄蚊成蚊为驱动方(Driver),进行正向抑制性消减杂交;以雄蚊成蚊为Tester、雌蚊成蚊为Driver,进行反向抑制性消减杂交。将获得的正向抑制性消减杂交产物克隆入pGEM-Teasyvector,并以菌液PCR扩增鉴定插入片段。随机抽取100个阳性克隆进行DNA序列分析,并将所得ESTs序列进行在线BLAST分析。结果从100个阳性克隆中测得98个ESTs序列,在测定的序列中与已知基因具有同源性的有57个,其余41个ESTs与已知基因不具有同源性。结论抑制性消减杂交技术建立雌蚊特异性基因文库,发现了淡色库蚊雌蚊新的ESTs序列,为性别相关基因的功能及性别调控,探讨媒介与病原、媒介与宿主的相互作用及其筛选传播阻断疫苗候选分子的研究奠定了基础。

嗜人按蚊雌蚊消减cDNA文库的构建及分析

目的 构建嗜人按蚊雌雄蚊差异表达cDNA文库。为进一步筛选、克隆嗜人按蚊雌雄蚊差异新基因奠定基础。方法 以嗜人按蚊为实验模型．分别将雌蚊和雄蚊作为T组和D组．采用抑制消减杂交方法和T／A克隆技术构建嗜人按蚊差异表达cDNA文库。扩增正向消减cDNA文库获得3000余个阳性克隆．随机挑取100个克隆进行PCR扩增，90％的克隆中均有200～1000bp的插入片段。测序显示．有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆，去除重复序列，得到72个EST序列．其中40与已知序列具有相似性．32个为新的EST序列。本项研究成功构建了嗜人按蚊雌蚊差异表达cDNA文库，获得了32个新的EST序列。从而为下一步筛选、克隆嗜人按蚊性别差异新基因打下了基础。

嗜人按蚊雌蚊差异表达基因的鉴定及全长cDNA的克隆

目的鉴定和克隆嗜人按蚊雌蚊差异表达基因并对基因序列进行分析。方法以嗜人按蚊为试验模型,根据差异表达基因EST序列(GenBankTM接受号:EX916923)设计引物,采用实时定量PCR(real-time PCR)和RACE(rapid amplifica-tion of cDNAend)技术对雌蚊差异表达基因进行鉴定并扩增其cDNA序列。结果利用F=2-△△CT公式计算出雌蚊差异表达基因在雌蚊和雄蚊中的表达比值为267.49;差异表达基因全长mRNA序列为364bp,开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列经BLAST分析与致倦库纹(Culexquinque fasciatus)结构蛋白(tectin)及其他物种蛋白序列具有相似性。序列发送至NCBI获得接受号:FJ907236。结论该基因为雌蚊差异表达的基因,其全长mRNA序列的获得为进一步研究其生物学功能奠定了基础。