多发性骨髓瘤患者外周血CD4^+T淋巴细胞亚群特点研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者外周血CD4+T淋巴细胞亚群特点。方法用流式细胞术检测30例MM初诊患者、20例治疗后患者及10名健康志愿者(对照组)外周血CD4+T淋巴细胞亚群,比较分析3组之间调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞(Th)1、Th17比例及Treg/Th17、Th1/Th17比值。结果初诊MM患者外周血Th17比例明显高于对照组,Treg、Th1比例及Treg/Th17、Th1/Th17比值明显低于对照组。治疗后患者Treg、Th1比例及Treg/Th17、Th1/Th17比值较治疗前明显提高,Th1及CD4+CD25+细胞比例基本恢复至对照组水平,CD4+Foxp3+细胞比例及Treg/Th17、Th1/Th17比值仍明显低于对照组。结论 MM患者外周血Th17细胞在初始T细胞的分化过程中取得了极化优势。治疗后Th17细胞极化优势现象明显改善,Th17细胞可能参与了MM的疾病进程。

真性红细胞增多症患者外周血Th17和CD4^+CD25^+调节性T细胞亚群研究

目的探讨真性红细胞增多症(PV)患者外周血Th17和CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达情况。方法选取30例初发(PV)患者,30名健康体检者作为对照。应用流式细胞术检测PV患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg的比例,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆及刺激后外周血单个核细胞(PBMNC)上清液中的白细胞介素(IL)-17,并与健康对照组比较。结果 1PV组外周血Th17淋巴细胞比例(2.9±5.6)%高于健康对照组(1.6±4.2)%;PV组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例(2.0±5.4)%,低于健康对照组(4.6±4.4)%;2PV组血浆中IL-17表达水平(36±20)pg/mL,高于健康对照组水平(21±15)pg/mL;PV组IL-21水平(36±14)pg/mL,高于健康对照组(29±15)pg/mL。结论 PV患者外周血Th17淋巴细胞应答增强,而CD4+CD25+Treg细胞缺乏,发病可能与外周血Th17/Treg免疫应答失衡密切相关。

粒细胞集落刺激因子动员的外周血干细胞悬液诱导培养树突状细胞的研究

目的 研究粒细胞集落刺激因子 (G CSF)动员的外周血干细胞 (PBSC)悬液中单核细胞和造血干/祖细胞分别诱导培养的树突状细胞 (DC)的特性 ,探讨临床应用PBSC悬液诱导DC的前景。方法 健康供者经G CSF动员后采集PBSC ,分两种方法诱导培养树突状细胞 :①贴壁细胞 (单核细胞 )经粒—单核细胞集落刺激因子 (GM CSF) +白细胞介素 4 (IL 4 )培养 2周 ,培养结束前 4 8、2 4h分别加入肿瘤坏死因子 (TNF α)、布雷菲德菌素 (brefeldinA ,BFA ) ;②非贴壁细胞 (含CD34+细胞 ) ,加入Flt3Ligand(FL) +干细胞因子 (SCF) +GM CSF +IL 4培养 1周 ,再按前一种方法继续培养 2周。培养结束后 ,流式细胞仪分析细胞表型和胞质 (c)IL 10 +(PE标记 )、cIL 12 (P4 0 ) +(TC标记 )细胞。结果 新鲜标本含CD14 +细胞 ( 18 4± 8 6 ) % ,CD34+细胞 ( 0 9± 0 4 ) %。以PBSC悬液中的 2× 10 6单个核细胞为起始细胞 ,前一种培养方法获得 ( 1 6± 0 6 )× 10 5细胞 ,细胞表型 :CD11c+( 97 3± 5 2 ) % ,CD86 +( 88 2± 6 8) % ,CD83+( 5 9 6± 8 4 ) % ,HLA DR+( 96 5± 7 1) % ,CD1a+( 36 6±7 5 ) % ,cIL 12 (P4 0 ) +( 15 9± 5 1) % ,cIL 10 +( 1 2± 0 4 ) % ;后一种培养方法获得 ( 1 2± 0 4 )× 10 6细胞 。

脐带血树突状细胞的免疫功能研究

目的:探讨脐带血树突状细胞(DC)的免疫功能状况。方法:以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门4色荧光分析方法检测20例脐带血和20例外周血DC前体细胞亚群pDC1/pDC2(CD11c+CD123-/CD11c-CD123+)比值;酶联免疫吸附法检测其血浆相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平。结果:脐带血、成人外周血pDC1/pDC2比值无显著差异(P>0.05);脐带血血浆IL-12p40水平显著高于成人外周血(P<0.01),两者IL-10、IFN-γ、IL-4水平无显著差异(P>0.05)。结论:脐带血DC功能发育比较完善。

G-CSF动员的外周血干细胞悬液冷冻保存后诱导培养树突状细胞的研究

目的:研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血干细胞(PBSC)悬液中单个核细胞(MNC)冷 冻保存后经不同诱导途径培养的树突状细胞(DC)的特性,探讨PBSC悬液冷冻保存后诱导培养DC的方法。方法:用 两种保护液-80℃冷冻保存PBSC悬液,分析复苏MNC中CD34+细胞、CD14+细胞、CD14+PI+细胞,并分两种方法诱 导培养复苏MNC:贴壁细胞经粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)培养2周,培养结束 前加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)、布雷菲德菌素(BFA);非贴壁细胞经酪氨酸激酶3配体(FL)、干细胞因子(SCF)、GM -CSF、IL-4培养1周,再按前1种方法继续培养2周。培养结束后,流式细胞仪分析DC特性。结果:两组复苏 MNC与新鲜MNC比较:CD34+细胞含量均无明显差异(P>0．05);而CD14+细胞少,CD14+PI+细胞百分率高(P< 0．01);贴壁细胞少,贴壁细胞诱导培养DC效果不佳;非贴壁细胞扩增诱导均能获得大量成熟的激活的能够分泌IL -12(p40)的髓系DC。结论:PBSC悬液冷冻保存后能用于培养髓系DC,但培养方法应以扩增诱导为主。

滤泡辅助性T细胞亚群在慢性特发性血小板减少性紫癜患儿发病机制中的作用分析

目的探索滤泡辅助性T细胞(Tfh)在慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿中的作用机制。方法用流式细胞术检测38名健康儿童、35例ITP患儿外周血CXCR5+CD4+T细胞占CD4+T细胞的比例。采用酶联免疫吸附试验检测健康儿童、ITP患儿血浆白细胞介素-21(IL-21)浓度。结果与健康对照组相比,ITP患儿外周血CXCR5+CD4+T细胞占CD4+T细胞的比例显著增高[(13.86±7.53)%,(7.65±5.36)%,P<0.05]。经过激素治疗后,ITP患儿外周血中CXCR5+CD4+T细胞占CD4+T细胞比例有所下降[(13.8±0.41)%,(8.23±6.12)%,P<0.05]。初发ITP患儿外周血血浆IL-21浓度显著高于健康对照组[(80.47±25.79)μg/mL,(32.41±17.53)μg/mL,P<0.05]。经过激素治疗后,ITP患儿外周血血浆IL-21浓度有所下降,但两者差异无统计学意义[(80.47±25.79)μg/mL,(60.35±19.54)μg/mL,P>0.05]。结论慢性ITP患儿与健康对照组相比,存在Tfh细胞数量及功能异常,可能与慢性ITP的发病相关。

实验室检查在多发性骨髓瘤单克隆免疫球蛋白中的诊断价值

目的探讨多发性骨髓瘤单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的临床诊断价值。方法采用免疫固定电泳(IFE)、血清蛋白电泳(SPE)及免疫球蛋白定量(Ig)技术检测105例多发性骨髓瘤患者的血清和尿液,其中10例MM患者进行自体骨髓移植,对其血清M蛋白的表达进行跟踪检测。结果 105例多发性骨髓瘤患者血清免疫固定电泳M蛋白105例阳性,阳性率为100.0%;尿本周氏蛋白阳性76例,阳性率为72.4%(76/105)。25例血清M蛋白为轻链型患者尿本周蛋白阳性率为92.0%(23/25);血清蛋白电泳78例出现M带,检出率为74.3%(78/105);免疫球蛋白定量68例显著升高,阳性率为64.8%(68/105)。结论免疫固定电泳检测M蛋白对诊断MM具有高度的敏感性和特异性,是M蛋白定性和分型的重要指标;血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量检测M蛋白可早期筛查MM,减少误诊或漏诊;三项指标联合检测M蛋白对MM的诊断、病情监测、疗效评估及预后判断提供重要依据。

中国部分汉族人群362种HLA单倍型的家系调查及重组单倍型分析

本研究旨在发现中国人群人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-A-B-DRB1新单倍型,调查HLA单倍型分布特征。采用179个家庭及子女HLA-A、B、DRB1位点的基因分型结果,通过家系和HLA遗传模型特征分离分析791条HLA单倍型。结果发现4条新的HLA重组单倍型,重组位点位于HLA-DRB1基因座位,其中3条重组单倍型来自父源染色单体,1条来自母源染色单体,其比例为3∶1。HLA-DRB1与A或B基因位点重组率为0.92%(4/433)。通过家系调查HLA分离分析得到362种HLA-A-B-DRB1单倍型,其中A33-B58-DR17、A2-B46-DR9、A30-B13-DR7、A11-B13-DR15、A11-B75-DR12和A2-B46-DR14单倍型检出频率最高,与应用非血缘供者人群的HLA基因分布调查资料的结果一致,但A1-B63-DR12、A29-B46-DR15、A1-B61-DR10、A34-B35-DR9、A29-B54-DR4、A23-B13-DR16、A34-B62-DR15等单倍型是非血缘供者人群HLA基因分布调查资料为未被报道过的罕见单倍型。结论:通过家系HLA单倍型调查能清楚地确定HLA-A-B-DRB1单倍型型别。本研究结果将为人类HLA研究、器官移植及HLA疾病相关性分析等提供重要依据。

乳腺癌患者外周血树突状细胞亚群及其HLA-DR表达的变化

目的:探讨乳腺癌患者外周血树突状细胞(DC)亚群和其HLA-DR表达变化及血浆中DC相关细胞因子水平的变化。方法:4色荧光流式细胞术分析57例乳腺癌术前、术后1周、术后6个月的患者及正常对照的外周血DC前体细胞pDC1/pDC2(CD11c+CD123-/CD11c-CD123+)比值及其HLA-DR的表达;酶联免疫吸附法检测血浆细胞因子白细胞介素-12p40(IL-12p40)、白细胞介素-10(IL-10)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平。结果:57例乳腺癌患者中,2例Ⅲ期、4例Ⅳ期外周血pDC缺乏,其余患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期外周血pDC1/pDC2比值分别为1.62±0.59、1.41±0.63、0.91±0.32、0.81±0.29,均显著低于对照组(1.94±0.44,P<0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者术后1周pDC1/pDC2比值为1.71±0.47、1.52±0.54、1.04±0.36,与术前比较均无显著差异(P>0.05),但显著低于对照组(P<0.05);术后6个月pDC1/pDC2比值分别为1.92±0.72、1.63±0.65、1.28±0.34,与术前比较,均有显著提高(P<0.05),但与对照组比较,仅Ⅰ期患者恢复正常(P>0.05),Ⅱ、Ⅲ期患者仍然显著降低(P<0.05)。乳腺癌患者pDC亚群HLA-DR表达以及血浆中IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平及IL-12p40/IL-10、IFN-γ/IL-4比值与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。结论:Ⅰ-Ⅳ期乳腺癌患者外周血pDC1/pDC2比值降低,部分Ⅲ、Ⅳ期患者外周血pDC缺乏。pDC的HLA-DR表达及DC分泌相关细胞因子的能力没有同步变异。术后患者pDC亚群Ⅱ、Ⅲ期明显改善,Ⅰ期恢复正常。

粒细胞集落刺激因子动员对供者外周血细胞树突状细胞亚群的影响

目的:研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员对外周血单个核细胞(PBMNC)中树突状细胞(DC)亚群及其功能的影响。方法:以CD34-Lin-HLA-DR+细胞群设门4色荧光分析方法检测25例无关供者G-CSF动员前、后外周血细胞DC亚群;ELISA检测其血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4活性,并分析DC1/DC2(CD11c+CD123-/CD11c-CD123+)比值与CD34+细胞含量的相关性。结果:G-CSF动员后,供者PBMNC的DC1/DC2比值显著低于动员前(P<0.05);DC1/DC2与CD34+细胞含量呈负相关(r=-0.438,P<0.05),CD34+细胞/MNC≥0.4%时,DC1/DC2倒置;而血清相关细胞因子IL-12p40、IL-10、IFN-γ、IL-4水平无显著改变(P>0.05);DC2HLA-DR表达上调而CD83不表达。结论:G-CSF动员后,供者外周血CD34+细胞数量增加的同时,DC2数量也增加,这些DC2尽管HLA-DR表达上调,但仍处前体细胞状态,不直接分泌或调节Th2细胞分泌免疫抑制因子。

JAK2V617F点突变在真性红细胞增多症中的诊断价值

目的：探讨JAK2酪氨酸激酶点突变（JAK2V617F点突变）在真性红细胞增多症（PV）中的临床价值。方法：运用实时定量聚合酶链式反应（RQ—PCR）检测25例血红蛋白量（HGB）男185～200g／L，女165～200g／L组（A组）及18例血红蛋白量男、女〉200g／L组PV患者（B组）、30例健康体检者（C组）外周血单个核细胞JAK2V617F点突变率；并比较PV患者中JAK2V617F点突变阳性组与阴性组之间的年龄、性别、血红蛋白量（HGB）、红细胞压积（HCT）、白细胞数（WBC）、血小板数（BPC）等临床特征。结果：43例Pv患者外周血单个核细胞中JAK2V617F点突变率为88％；25例A组及18例B组PV患者外周血单个核细胞中点突变率分别为88％，89％，两组间无统计学差异，P〉0．05，30例C组点突变均为阴性；43例PV患者中，JAK2V617F点突变阳性组与点突变阴性组比较，两组在发病年龄、HGB、HCT均无统计学差异；阳性组白细胞计数、血小板计数分别为（12．8±6．0）×10^9／L、（486±108）×10^9／L，均显著高于阴性组的（7．9±1．1）×10^9／L、（320±97）×10^9／L，P〈0．05。结论：JAK2V617F点突变结合血红蛋白量测定可以作为真性红细胞增多症的辅助诊断依据。JAK2V617F点突变阳性组与阴性组患者临床特征存在一定差异。

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

目的研究短发夹RNA（shRNA）对耐三氧化二砷（As2O3）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法设计并合成3条针对MRP1基因的shRNA序列，在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞；用荧光实时定量PCR分析MRP1 mRNA的表达水平；流式细胞术检测MRP1蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量。结果经MRP1 shRNA作用24h后，K562／AS2细胞株中MRP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降，最大下调幅度分别为（79．1±0．07）％和（62．48±0．86）％（P〈0．05），同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加（P〈0．05）。结论MRP1 shRNA可抑制As2O3，耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞MRP1基因的表达。

血常规检验在地中海贫血和缺铁性贫血诊断与鉴别诊断中的应用分析

目的分析血常规检验在地中海贫血和缺铁性贫血诊断与鉴别诊断中的应用。方法选取我院地中海贫血患者50例(A组)、缺铁性贫血患者50例(B组),选取时间范围为2017年5月10日-2018年5月10日,对比两组患者血常规检查结果指标。结果 A组贫血患者RDW(12.2±1.2)%,MCV(68.3±2.1)fL,MCHC(319.6±4.4)g/L,结果与B相比较,P<0.05;MCH指标结果差异不大,P>0.05。结论在血常规检验当中,MCHC、MCV、RDW是区分地中海贫血及缺铁性贫血重要指标,血常规检验具有重要意义。

TFPI-2对K562细胞体外生长和侵袭能力的影响

目的研究组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因对白血病细胞系K562细胞生长和侵袭的影响。方法通过脂质体法将TFPI-2基因转染到K562细胞,用实时定量RT-PCR和Western blot分别检测转染前后TFPI-2mRNA和其蛋白质的表达。生长曲线测定,平板克隆和(Transwell)小室穿透实验测定转染前后3组细胞生长、恶性增生能力以及体外侵袭能力的差异。结果转染成功TFPI-2基因的K562细胞(K562-T)有TFPI-2mRNA及其蛋白质的表达,与对照组K562组、K562-V组细胞相比,K562-T细胞生长速度缓慢,克隆形成率明显低于前2组(P<0.05),有统计学意义;其穿膜细胞数(16±4.51)明显低于前两者(33.67±4.51)及(28.67±3.51),P<0.05,有统计学意义。结论TFPI-2基因对K562细胞的生长和侵袭能力有抑制作用。

深圳地区12960例地中海贫血筛查受检者的地中海贫血基因型分析

目的探讨深圳地区地中海贫血基因型特征，及其罕见基因型碱基突变位点。方法选择2014年5月至2015年10月于广东省深圳市第二人民医院拟行地中海贫血筛查的12960例受检者为研究对象。研究对象纳入标准：①红细胞平均体积（MCV）〈80fl的门诊及住院患者；②于本院行产前筛查的孕妇。排除标准：①不愿意参加本试验者；②已被确诊为其他血液系统疾病者。受试者先进行血常规MCV、血红蛋白（Hb）电泳和红细胞脆性检测的地中海贫血筛查试验，对筛查试验阳性（红细胞脆性〈70％）的患者，采用跨越断裂点PCR及反向斑点杂交（RDB）技术进行地中海贫血基因常见缺失型和点突变的基因型检测。对常见基因型检测不能确诊的患者，采用巢式PCR和PCR-直接测序（SBT）技术进行罕见基因型分析。本研究遵循的程序符合深圳市第二人民医院制定的伦理学标准，得到该委员会批准，并征得受试对象本人的知情同意，与之签署临床研究知情同意书。结果12960例受检者中，地中海贫血筛查试验阳性患者为2194例，通过常见基因型检测，确诊1019例为地中海贫血，检出率为46．4％。537例a地中海贫血患者中，以东南亚缺失型（--^SEA／αα）比例最高，占66．1％（355／537），其次为α地中海贫血2（-α^3.7／αα）占15．6％（84／537），而基因型（α^CSα／α^CSα、α^QSα／α^Qsα、α^WSα／α^WSα）和4种HbH病基因型（-α^3.7／α^QSα^QS、--^SEA／α^CSα^CS、--SEA／α^QSα^QS、--^SEA／α^WSα^WS）较为少见。α地中海贫血罕见基因型检出率为0．1％（3／2194），包括2例HKαα／^--^SEA及1例HKαα/αα。在456例β地中海贫血患者中，β^41-42（-TCTT）／β和β^654（C〉T）/βA基因型检出率最高，分别为33．8％（154／456）和30．3％（138／456）。在26例β复合α地中海贫血患者中，以p复合a地中海贫血1（--^SEA／αα）基因型检出率最高（34．6％，9／26）。β地中海贫血罕见基因型检出率为0．2％（4／2194），包括2例β^37（G〉A）,突变点为413G〉A或405G〉A，1例β^88-93（-AGTG），突变点为557处出现杂合峰，1例β^-88（C〉T），突变点为-88C〉T。结论深圳地区地中海贫血基因型有独特的分布特征，巢式PCR技术有助于发现HKαα／--^SEA及HKαα／αα基因型。采用PCR—SBT技术能鉴定罕见地中海贫血基因型并发现新突变点。本研究结果为在深圳地区开展遗传咨询和产前诊断提供了参考数据。

中国南方汉族急性淋巴细胞白血病患者572例的HLA基因和单倍型分析

目的研究HLA—A、B、DRB1基因和单倍型与中国南方汉族急性淋巴细胞白血病（ALL）的疾病相关性。方法应用最大似然性方法分别计算南方汉族ALL患者组572例和5645名南方汉族健康供者HLA—A、B、DRB1基因和单倍型频率，采用X^2检验方法比较其分布差异。结果ALL组HLA—A33、B58和DRB1^＊17基因频率均低于对照组[HLA—A33（7．15％比93％，OR=0．73，P〈0．05）、B58（5．93％比8．75％，OR=0．64，P〈0．05）和DRB1^＊17（5．15％比6．30％，OR=0．82，P〈0．05）]；A3、B51和DRB^＊12基因频率均高于对照组[A3（2．1％比1．26％，OR=1．7，P〈0．05），B51（7．25％比5．78％，OR=1．3，P〈0．05）和DRB^＊12（16．13％比12．99％，OR=1．35，P〈0．05）]；HLA—A33-B58-DRB1^＊17单倍型频率低于对照组（2．46％比4．14％，OR=0．35，P〈0．05），A2-B51-DRB1^＊12单倍型频率高于对照组（1．24％比0．89％，OR=1．66，P〈0．05）。结论携带有A33-B58-DRB1^＊17单倍型个体可能与降低ALL的发病风险有相关性，A3基因和A2-B51-DRB1^＊12可能与增加ALL发病风险有弱相关性。

慢性免疫性血小板减少性紫癜患者滤泡辅助性T细胞变化的研究

目的 探讨滤泡辅助性T细胞（Tfh）在成年人慢性免疫性血小板减少性紫癜（ITP）免疫发病机制中的作用.方法 采用流式细胞术检测42例慢性ITP患者治疗前后、42名健康者外周血CXCR5＋CD4＋细胞比例,采用酶联免疫吸附试验检测血浆白细胞介素（IL）-21浓度.结果 初发ITP患者组外周血中CXCR5＋CD4＋T细胞占CD4＋T细胞比例高于健康对照组[（12.15±6.82）％比（8.79±4.91）％,P＜ 0.005];经过激素治疗后,ITP患者外周血中CXCR5＋CD4＋T细胞占CD4＋T细胞比例有所下降[治疗后（9.01±5.13）％,P＜ 0.001],治疗后与健康对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）.初发ITP患者外周血血浆IL-21浓度高于健康对照组[（97.56±29.48） μg/ml比（30.36±12.93） μμg/ml,P＜0.001];经过激素治疗后,ITP患者外周血血浆IL-21浓度较治疗前有所下降[治疗后（67.35±20.58） μμg/ml,P＜0.001],但仍高于健康对照组（P＜ 0.001）.结论 慢性ITP患者存在Tfh细胞分布及功能异常,可能与慢性ITP的发生发展有关.