中国汉族个体HLA-A、-B基因全长序列的测定及调控区多态性

文章利用20个中国汉族个体样本建立了稳定精确的HLA-A、-B基因全长序列的克隆测序方法,获得HLA-A 10个等位基因4.2 kb序列,HLA-B 6个等位基因3.7 kb序列,序列涵盖了两个基因的所有外显子、所有内含子、5′启动子区以及3′非翻译区(3′UTR)。A*1153是文章发现的一个新等位基因,B*151101的内含子序列、5个HLA-A以及2个HLA-B等位基因的5′启动子序列和3′UTR序列为国际上首次报道,其他等位基因均延伸了IMGT/HLA数据库中释放的全长序列。文章首次在中国汉族个体中测定了IMGT/HLA数据库中没有覆盖的HLA-A、-B基因的上游5′启动子以及下游3′UTR区域的多态性模式。HLA-A基因5′启动子延伸区域共发现26个SNPs和一处3 bp(AAA/-)的插入/缺失,3′UTR延伸区域共发现14个SNPs;HLA-B基因5′启动子延伸区域共发现5个SNPs和一处1 bp(T/-)的插入/缺失,3′UTR延伸区域共发现8个SNPs。通过对两个基因的5′启动子、外显子以及3′UTR的系统发育树分析,发现两个基因调控区与外显子的进化关系有所不同,HLA-A基因除A*24020101外,其他等位基因两端调控区与外显子连锁比较紧密,HLA-B基因两端调控区与外显子之间则发生了较为频繁的重组事件。

南方汉族强直性脊柱炎患者及健康人群HLA-B27基因的分子多态性及分布

目的研究南方汉族强直性脊柱炎(AS)患者及健康人群HLA-B27亚型等位基因的多态性和分布特点。方法采用HLA测序分型方法,对收集到的46份B*27阳性的南方汉族AS患者血样以及随机选择的80份经rS-SOHLA流式磁珠低分辨检测为B*27阳性的造血干细胞南方汉族捐献者血样,做HLA-B基因的第2—4外显子测序分型,测序反应产物用ABI PrismTM3730测序仪检测,Assign3.5分析软件分析结果。对检出的模棱两可结果及"罕见型"等位基因,辅以PCR-SSP法HLA-B27高分辨基因分型。结果46名南方汉族AS患者中,共检出4个HLA-B*27相关的等位基因:B*2704的检出比例最高,为82.98%(39/47);其次是B*2705,为12.77%(6/47);B*2707和B*2724各为2.13%(1/47)。80名南方汉族造血干细胞捐献者中,共检出7种B*27相关等位基因:以B*2704的检出比例最高,为57.32%(47/82);其次为是B*2705,为26.83%(22/82);B*2706和B*2707各为6.10%(5/82);B*2703、B*2715和B*2724各为1.22%(1/82)。结论南方汉族AS患者HLA-B*27基因中以B*2704最为常见,健康人群以B*2704和B*2705等位基因为主要亚型。

汉族人群中22个HLA-Cw等位基因全长序列单核苷酸多态性分析

为探讨HLA-Cw(Human leukocyte antigen-Cw)基因全长序列分子遗传多态性,文章对28个HLA-Cw基因型已知的汉族个体样本,采用长距离PCR技术和高保真性的Pfu酶,扩增HLA-Cw基因全长序列4.5kb,进行分子克隆和单倍体测序。采用群体遗传学研究方法分析了HLA-Cw等位基因全长序列中各亚区的单核苷酸多态性。结果表明:在28个样本中共检测出22种等位基因,序列均已提交GenBank和国际IMGT/HLA数据库并获得了认可;其中Cw*0706、Cw*030301、Cw*140201的全长序列为首次报道,尤其是Cw*0706内含子序列的获得,能够重新设计对该等位基因测序分型的引物,避免测序分型中可能对这一等位基因的漏检。将28个样本的56条单倍体序列用Clustal软件进行序列排比,输入到DnaSP4.0进行多态性分析,共发现244个SNPs,10处插入/缺失多态性。对HLA-Cw等位基因各亚区多态性的分析,发现第4内含子及以前并没有受到关注的第5外显子受到平衡选择的作用,在进化中受到了选择压力,预示着它们在免疫系统的进化过程中可能扮演着重要的角色。

中国汉族个体HLA-Ⅰ类基因全长序列鉴定及多态性比较

目的鉴定中国汉族个体HLA-Ⅰ类3个基因座-A、-B、-C的全长序列并比较其各亚区多态性。方法利用前期已建立的HLA-Ⅰ类基因3.7-4.5 kb全长序列高保真扩增、克隆及步移测序方法,从业已经过HLA高分辨测序分型、结果已知的1 000(人)份中国汉族造血干细胞捐献者的血样中,分别选择含HLA-A、-B、-C所有血清学家系等位基因的标本45、38、52份做序列鉴定与比较。结果共获得汉族个体HLA-Ⅰ类基因110条全长序列,包括38个HLA-A等位基因4.2 kb序列,30个HLA-B等位基因3.7 kb序列,以及42个HLA-C等位基因4.3-4.5 kb序列;所获110个等位基因的全长序列均提交Gen Bank及IMGT/HLA数据库,获得WHO命名委员会的命名,其中首次报道全长序列的等位基因有70个,包括新等位基因21个、修正序列的等位基因2个、5'-启动子序列及3'-UTR序列或内含子序列的等位基因47个,其他40个等位基因均在5'-启动子及3'-UTR区,延伸了IMGT/HLA数据库中释放发布的全长序列。结论 1)所鉴定的全长序列可为HLA-Ⅰ类基因测序分型引物和探针的正确设计、HLA基因表达调控、分子进化及疾病关联等研究,提供详实的基础资料和信息;2)中国汉族个体HLA-C基因的第2、3外显子及3'-UTR区,与HLA-A、-B相应区域比较,其全长序列多态性水平及分布较独特,暗示HLA-C基因免疫学功能的独特性。

HLA-E基因多态性与白血病的相关研究

目的探讨HLA-E基因多态性与白血病的相关性,为白血病的发生发展机制提供新的分子标记。方法提取白血病患者组(n=59)及正常人群(对照)组(n=132)外周血DNA,利用长片段高保真PCR方法做HLA-E全长序列扩增并对HLA-E的第3外显子测序并分型;分别计算2组中各基因型的频率及各等位基因的频率。结果白血病患者组:共检出35例纯合子,检出率59.3%(35/59),其中29例(49.2%)为HLA-E*01:03纯合子、6例(10.2%)为HLA-E*01∶01纯合子;正常对照组:共检出62例纯合子,检出率47.0%(62/132)其中36例(27.3%)为HLA-E*01:03纯合子、26例(19.7%)为HLA-E*01∶01纯合子;白血病患者组和正常对照组HLA-E*01∶03等位基因频率分别为69.5%vs 53.7%(P<0.01),2组HLA-E*01∶03纯合子比例分别为49.2%vs 27.3%(P<0.01,OR=2.1)。结论 HLA-E*01∶03是白血病的易感基因。

人类白细胞抗原E基因全长序列测定及两个新等位基因的鉴定

背景:人类白细胞抗原E是非经典的人类白细胞抗原I类分子,目前的多态性分析研究主要针对其第3外显子人类白细胞抗原E~*01:01及人类白细胞抗原E*01:03进行区分,然而其全基因序列测定方法及新等位基因报道尚不多见。目的:利用中国深圳地区无偿献血正常个体建立人类白细胞抗原E基因全长序列测序分型方法,鉴定人类白细胞抗原E基因全长序列新的等位基因。方法:提取研究对象外周血DNA,根据IMGT/HLA数据库中公布的人类白细胞抗原E基因序列,在保守区设计全基因扩增及测序引物,利用高保真反应体系对人类白细胞抗原E全长序列进行扩增,随后测序、拼接、序列确认及基因定型。结果与结论:(1)成功建立了人类白细胞抗原E的全基因扩增及测序分型方法,发现了两个人类白细胞抗原E新等位基因——人类白细胞抗原E~*01:01:01:06与人类白细胞抗原E~*01:01:01:07,获得了WHO人类白细胞抗原命名因子委员会的命名;(2)人类白细胞抗原E~*01:01:01:06与其最接近的等位基因人类白细胞抗原E~*01:01:01:01相比,突变位点在5’-启动子区的NT-26(G->T),人类白细胞抗原E~*01:01:01:07与其最接近的等位基因人类白细胞抗原E~*01:01:01:01相比,突变位点在3’-非翻译区的NT3345位(T->C);(3)结果提示,中国人群中人类白细胞抗原E全基因序列多态性数据有待填补,试验建立的方法为该项研究提供了关键的技术。

一个罕见HLA—C等位基因间重组家系的遗传背景研究

目的 研究HLA-C等位基因座位上的交换重组,探讨HLA新等位基因产生的分子遗传背景.方法 采集拟进行造血干细胞移植的1例慢性粒细胞白血病患者、患者父母以及2名哥哥的静脉血,采用AlleleSEQR HLA 测序分型试剂进行HLA-A、C、B、DRB1和DQB1共5个位点的高分辨基因分型;再采用Protrans S4 HLA单倍体测序技术分离2个HLA-C等位基因,以确定序列异常的1个C等位基因;进一步采用分子克隆和测序方法进行患者及父母HLA-C等位基因的全长单倍体序列分析.按遗传规律分析该家系的HLA 5个位点的连锁单倍型,同时将HLA-C等位基因全长序列经IMGT/HLA Database中的＂BLAST＂程序进行序列的对比,以确定C等位基因重组发生的精确位置.结果 经HLA测序及遗传家系分析,该家系中父亲的2条HLA连锁单倍型分别为a：A＊0207-C＊010201-B＊550201-DRB1＊090102-DQB1＊030302与b：A＊240201-C＊120202-B＊5201-DRB1＊1502-DQB1＊0601;母亲的分别为：c：A＊300101-C＊060201-B＊130201-DRB1＊0405-DQB1＊0401与d：A＊110101-C＊070201-B＊4001-DRB1＊080302-DQB1＊0601.患者的2名哥哥均分别正常遗传了父母的2条单倍体a、d及b、c.患者的2条单倍体分别为母源单倍体c及父源重组单倍体a/b,其中A＊240201来自父亲的1条染色单体b,而B＊550201-DRB1＊090102-DQB1＊030302则来自父亲的另1条染色单体a.对比患者携带的C未知新等位基因与父亲的1对C＊010201 、C＊120202等位基因的全长单倍体序列,推断父亲的2条染色单体在减数分裂时,由于HLA-C等位基因的第273位至330位碱基区域之间发生了交换,重组后形成新的C等位基因及单倍型并遗传给了患者.该C新等位基因的全长序列已递交GenBank,并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为C＊0121.结论 本研究发现了1个罕见的中国汉族人群HLA-C基因座位上的基因重组家系,阐明了HLA-C＊0121新等位基因及单倍型的产生来源,为更深入研究基因重组及HLA多态性形成机制提供了理论依据.

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术。方法设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系，采用长距离PCR技术，扩增HLA-Cw基因非翻译区（untranslatedregion，5′-UTR）区、8个外显子、7个内含子和3′-UTR区，全长约4．5kb。PCR产物纯化后进行分子克隆，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，采用自行设计的测序引物进行全长双向测序。12份已经AlleleSEQRHI。A-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本，分别用TaKaRaLATaq酶和StratagenePfuTaqDNA聚合酶进行HI，A-Cw基因全长扩增，以及PCR产物分子克隆和序列测定，克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析。结果PCR扩增获得了特异性目的片段，测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列。克隆测序结果的对比表明，Pfu酶保真性高于LATaq酶。比较本文测定的Cw＊010201与Cw＊07020101等位基因序列，在5′上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和2个插入（或）缺失多态性位点；3′-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入（或）缺失。结论建立了HLA—Cw基因全长序列分子克隆及测序方法，在HLA—Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域，具有广泛应用前景。

五例样本HLA-C基因测序分型中等位基因丢失及其原因分析

目的探讨HLA-C基因测序分型时等位基因漏检和丢失的原因，以提高HLA测序分型的成功率和准确性。方法620份随机选择的深圳健康捐血者血样，采用AlleleSEQRHLA—Cplus测序分型试剂盒进行检测，对无完全匹配、分型结果“异常”的标本，采用分子克隆和测序方法进行全长单倍体序列分析；对未检出新的碱基点突变的样本，进一步采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物进行再测序，分析测序分型结果“异常”的原因。结果620份经AlleleSEQRHLA—C测序分型的样本中，发现5例样本无完全匹配的基因型，与之最接近的多种等位基因型均存在单个碱基的不匹配；并且在第4外显子出现碱基杂合，但第2和第3外显子区域内无杂合碱基。经分子克隆和单倍体测序，以及采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物再测序，证实了5例标本均存在Cw＊0706等位基因漏检和丢失现象，未发现新的碱基点突变。结论HLA-C基因测序分型时，因PcR引物与模板DNA不匹配会导致等位基因的漏检和丢失。根据中国人群HLAC分子全长序列特点，开发适合于中国人群的测序分型试剂十分必要。

测序分型中2例样本HLA-DQB1等位基因第2外显子PCR扩增丢失及其原因分析

目的探讨HLA-DQB1基因测序分型时等位基因漏检和丢失的原因，以进一步提高HLA测序分型的准确性。方法对2000份HLA高分辨组织配型血样，采用AlleleSEQRHLA-DQ脚测序分型试剂盒进行常规检测。对序列峰图“异常”及无完全匹配结果的样本，进一步采用PCR-rSSO流式磁珠法复检，同时采用自行设计的特异性引物进行PCR产物分子克隆和测序，进行单倍型序列分析。结果在2000份经AlleleSEQRHLA-DQ剧测序分型的样本中，共发现2例样本序列峰图“异常”。经PCR-rSSO流式磁珠法和自行设计的引物测序复检，确认其为杂合型样本。PCR产物分子克隆和单倍型序列分析证实，第1份样本为第2外显子PCR扩增丢失HLA-DQB1 ＊02：02等位基因序列。第2份样本为第2外显子PCR扩增丢失HLA-DQB1 ＊02：01：01等位基因序列，未发现新的碱基突变。结论HLA-DQB1基因测序分型时，因DQB1基因存在优势扩增现象，可导致HLA-DQB1第2外显子等位基因的漏检和丢失。上述发现将为HLA精确分型提供借鉴。

人类白细胞抗原HLA-Cω基因第2,3,4外显子测序分型方法的初步研究

目的 初步建立可靠的HLA-Cω基因第2、第3和第4外显子测序分型技术.方法 基于中国汉族人群HLA-Cω基因的全长序列,设计和合成1对PCR引物,采用Stratagene P fu Taq DNA聚合酶特异性扩增HLA-Cω基因5＇-启动子区至第4内含子目的基因片段,涵盖完整的第1～4外显子.PCR产物经纯化,采用自行设计的6条测序引物和ABI PRISM BigDye 1.1 Terminator,以及优化的测序反应体系和PCR条件,对HLA-Cω,基因第2、第3和第4外显子进行双向测序.测序反应产物纯化后,采用ABI3730测序仪电泳和Assign 3.5 SBT软件分析结果.结果 PCR扩增获得了清晰的HLA-Cu,基因日的片段,所用的6条测序引物进行HLA-Cω基因第2、第3和第4外显子测序,序列中无背景信号和杂峰.156份汉族随机骨髓志愿捐献者样本用本文的方法检测.分型结果与Atria AlleleSEQR HLA-Cw Plus测序分型试剂盒的结果相一致.结论 初步建立了可靠的HLA-Cω基因测序分型方法,在HLA-Cω基因群体遗传学及组织配型等领域,具有广泛应用前景.

PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的研究

目的探讨PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的可能性。方法采用本实验室建立的HLA—c基因测序分型方法中的PCR扩增、测序反应和测序纯化等步骤，对96份标本特异性扩增HLA—C基因外显子1～4目的序列片段约为2000bp，扩增产物分别采用OMEGA公司（瑞士）磁珠纯化法及USB公司（美国）的外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶的混合物和Atria HLA-C SBT plus试剂盒配套使用的外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶的混合物进行纯化和平行对照，经HLA—C基因第2、3和4外显子双向测序反应，纯化后的测序反应产物采用ABI3730测序仪电泳检测，Assign3．5．1．45分析软件判定结果，统计可判定受检者HLA基因型的样本的总数，并计算BCS（base calling score）平均值。结果经磁珠纯化法纯化PCR扩增产物测序反应后得到的序列质量BCS平均值为81．191±3．539；AtriaExoSAP—IT纯化后测序反应所获得序列BCS平均值为79．946±3．778，USB外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶的混合物测序反应所获得序列BCS平均值为70．384±5．778。上述纯化方法的碱基A，G，C和T的峰高均在1000以上；平均每人份10μl扩增产物的纯化成本，磁珠法明显比外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶的混合物法便宜很多。结论磁珠纯化试剂成本低、无需冷冻保存，HLA测序分型中序列质量效果较好，具有良好的实用价值。

HLA-A和HLA-B与HLA-DRB1基因低分辨相合的无关供／受者对HLA高分辨水平匹配性分析

目的分析探讨HLA-A、HLA-B和HLA-DRBl基因低分辨相合无关供／受者对与HLA高分辨水平匹配的比例和特点。方法对318份HLA-A、B和DRBl基因低分辨相合的无关供／受者对标本进行HLA测序分型，从高分辨水平统计和分析HLA各基因座匹配的比例和特点，以及HLA系统中6个等位基因（HLA-A、HIA-B和HLA-DRB1位点）、8个等位基因（HLA-A、HLA-B、HLA-Cw和HIJA．DRB1位点）、10个等位基因（HLA-A、HLA—B、HIJA-Cw、HLA-DRB1和HLA-DQB1位点）的匹配性。结果单个HLA位点完全相合的比例为HLA-B[79．9％（254／318）]〉HIJA．DRB1[64．8％（206／318）]〉HLA-DQB1[62．3％（134／215）]=HLA-A[62．3％（198／318）]〉HLA-Cw[55．3％（119／215）]。6个等位基因完全相合的比例为36．2％（115／318），8个等位基因完全相合的比例下降为21．9％（47／215），10个等位基因完全相合的比例为20．5％（44／215）。在76份HLA-A、HIJA-B和HLA-DRBl等位基因6／6相合的样本中，等位基因8／8相合及10／10相合的比例分别为63．2％（48／76）和57．9％（44／76）；但其中1～2个HLA-Cw等位基因不相合的比例为36．8％（28／76），且主要为抗原水平不相合。结论实现HLA-A、HLA-B、HLA-DRBI的高分辨分型数据入库虽有助于提高无关供／受者对与HLA高分辨配型检索的成功率，但HLA-Cw抗原水平的不相合不能被忽视，建议将HLA-Cw基因分型纳入骨髓库骨髓志愿捐献者HLA入库数据的常规检测。

新等位基因MICA＊065的鉴定及其序列分析

目的 鉴定中国深圳地区人群中新发现的1个主要组织相容复合物Ⅰ类相关基因A位点（MICA）等位基因,并对该新MICA基因的突变情况进行分析.方法 选择2012年1～12月,于深圳市血液中心行组织配型的供、患者中,1例MICA基因分型异常的健康供者作为研究对象.采用自主建立的基于聚合酶链反应-碱基序列直接测序（PCR-SBT）法对本例供者MICA基因第2～5外显子进行测序分型,利用分子克隆和单倍体测序的方法,鉴定出该个体MICA等位基因的序列.利用序列比对方法,对该MICA等位基因的突变情况进行分析.结果 于本例供者血液样品中,检出了1个新变异的MICA等位基因,其序列与MICA＊ 010∶01最为相近,但存在基因组DNA nt 637位点的碱基由胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）,MICA基因第4外显子中的第1 91位密码子由CGC变异为TGC,导致氨基酸由精氨酸变异为半胱氨酸,该序列提交国际GenBank数据库（序列号：JN043370）和国际免疫遗传学信息系统/人类白细胞抗原（IMGT/HLA）数据库（序列号：HWS10013775）,已被命名为MICA＊ 065.结论 新等位基因MICA＊ 065的变异碱基T,是1个全新的随机突变位点,未在MICA其他等位基因中发现.

中国汉族个体HLA全长序列新等位基因A＊74：02：01：02的鉴定

目的对中国汉族个体人类白细胞抗原（HLA）-A基因全长序列进行测定，发现和鉴定突变位于常规检测区域以外的全长序列新等位基因。方法应用已对常规检测区域第2～4外显子进行测序分型、结果已知的中国汉族个体的样本进行HLA—A基因全长4．3kb序列的高保真扩增、克隆及测序；利用序列比对、进化树等方法分析突变所在位置及其产生的原因。结果发现1个HLA—A全长序列新等位基因，序列与国际IMGT／HLA数据库中最接近的等位基因A＊74：02：01：01的全长序列相比共有5个位于内含子的变异，其中第3内含子1个：NT1427C〉T，第7内含子5个，分别为NT2842G〉A，NT2850C〉T，NT2862T〉C，NT2863G〉A以及NT2868T〉C。该HLA—A新等位基因于2010—07—31被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA—A＊74：02：01：02。结论新等位基因A＊74：02：01：02的变异产生的机制可能是随机突变和等位基因之间的交换重组。