HLA-DRB1座位的等位基因多态性与乳腺癌遗传易感关系的研究

目的研究乳腺癌与人类白细胞抗原Ⅱ类基因DRB1座位等位基因的相关性。方法病例组为临床已确诊的乳腺癌患者112例,均使用LUMINEX 200液相分析平台,采用序列微珠综合分析实验技术(FLOW-SSO)方法进行HLA分型。对照组为"中华造血干细胞志愿捐献者资料库"广东分库的志愿捐献者20 621例,采用FLOW-SSO和SBT方法进行HLA分型,对不确定结果采用PCR-SSP分型试剂进行确认。所有检测样本的DNA使用瑞士TECAN公司DNA提取自动工作站从EDTA-K2抗凝的外周全血中抽提。结果在112例乳腺癌患者中共检测到HLA-DRB1座位等位基因27个。病例组与对照组两个群体的HLA-DRB1座位等位基因的分布差异有统计学意义(χ2=42.39,P<0.05)。其中HLA-DRB1*0408在病例组中的分布频率高于对照组(χ2=4.19,P<0.05),相对危险度RR=6.34(χ2=4.20,P<0.05);HLA-DRB1*0901在病例组中的等位基因频率为0.205 4,高于对照组中的0.150 1(χ2=5.33,P<0.05),相对危险度RR=1.63(χ2=6.50,P<0.05);HLA-DRB1*0701在病例组中的分布频率仅为0.026 8,低于对照组中的0.086 1(χ2=10.00,P<0.05),相对危险度RR=0.24(χ2=11.37,P<0.05)。其他等位基因的频率分布差异及相对危险度经χ2检验差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HLA-DRB1*0408、HLA-DRB1*0901可能是乳腺癌的易感基因,而HLA-DRB1*0701可能是乳腺癌的保护基因。

青光眼睫状体炎综合征与杀伤细胞免疫球蛋白样受体-人类白细胞抗原受配体复合物遗传多态性的相关性研究

目的 研究和分析南方汉族人群青光眼睫状体炎综合征（PSS）与杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）及其人类白细胞抗原（HLA）配体基因多态性的相关性.方法 随机选择100例无关健康个体作为对照组,收集97例临床诊断为PSS的患者血样,采用KIR PCR-SSP方法检测KIR框架基因的有无,PCR-SBT法进行HLA-A、B、C基因的测序分型;统计分析健康对照组与患者的KIR框架基因频率、KIR基因单倍体组合型的频率、HLA配体的频率、单个KIR-HLA配体复合物的频率之间的差异.结果 与正常人群相比,PSS患者KIR框架基因频率及单倍体组合型频率差异无统计学意义（P均＞0.05）;HLA配体中的HLA-Bw4-80T在PSS患者及正常人群中的比例分别为22.1％和41.0％,差异有统计学意义（P＜0.01）;KIR-HLA配体组合中的3DL1＋ HLA-Bw4-80T在PSS患者及正常人群中的比例分别为22.1％和40.0％,差异有统计学意义（P＜0.05）,患者组与正常人群组相比都显著降低.结论 PSS与KIR框架基因及单倍型频率无关,但可能与HLA配体或KIR-HLA配体组合相关,这对研究PSS的发病机制及治疗方法具有重要意义.

应用完整外显子2/3序列解决HLA-DRB1座位基因分型的歧义结果

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当等位基因的差异碱基位于测序范围之外或不同等位基因对的杂合序列相同时,无法得到清晰的结果。目的:通过完整外显子2/3序列的测定,解决常规HLA-DRB1基因分型中的高比例歧义结果。方法:初次分型采用常规的测序方法检测320份样本的HLA-DRB1外显子2第一高变区以外的序列,测序反应设置codon86。后期采用一次性扩增外显子2/3,测序反应针对外显子2设置组特异性引物:DRB1*04/07/09为一组,其它基因家族为一组,设置conden86,对初次分型后为歧义结果的样本重新分型。结果与结论:初次分型有180份样本为歧义结果,占总样本数的56.25%。其中A类为差异碱基位于测序范围之外,共114例;B类为等位基因对的杂合序列相同,共17例;C类为两种情况同时存在,有49例。3种类别的歧义等位基因数分别为119个、34个、98个,占等位基因总数的33.06%、9.44%、27.22%。完整外显子2/3序列的测定使歧义结果比例从56.25%下降到14.37%,其中A类103例、B类8例、C类23例样本的等位基因得到确认。此次研究中发现了一个新等位基因,与跟它最相近的等位基因DRB1*110101相比,其外显子3的第381位碱基G>T,导致第98位氨基酸AAG(赖氨酸Lys)>AAT(天冬酰氨Asn)。序列已提交Genbank,编号HM807583,2010-08被世界卫生组织HLA因子命名委员会命名为HLA-DRB1*1197(编号HWS10010999)。提示,完整外显子2/3序列的测定能大幅降低歧义分型结果的比例。

中国南方汉族人群HLA—Ⅰ、Ⅱ类八个位点等位基因多态性的研究

目的研究中国南方汉族人群人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A、B、C、DRB1、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因的多态性。方法采用聚合酶链式反应-测序分型方法（sequence based typing，SBT）对481名随机南方汉族个体的HLA-A、B、C、DRB1、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1基因进行序列分析，用直接计数法计算等位基因频率。结果共观察到HLA-A、B、C、DRB1、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因数分别为28、57、28、40、18、17、6和21个。其中频率高于0．05的常见等位基因有A＊1101、A＊2402、A＊0207、A＊3303和A＊0201;B＊40：01、B＊46：01、B＊58：01、B＊13：01和B＊15：02；C＊01；D2、C＊07：02、C＊03：04、C＊03：02、C＊D8：D1、C＊03；03和C＊04：01；DRB1＊09：01、DRB1＊15：01、DRB1＊12：02、DRB1＊08：03、DRB1＊03：01、DRB1＊04：05和DRB1＊11：01；DQA1＊01：02、DQA1＊03：02、DQA1＊03，03、DQA1＊06：01、DQA1＊01：03、DQA1＊D5：05、DQA1＊01：04、DQA1＊03：01和DQA1＊D5：01；DQB1＊D3：01、DQB1＊03：03、DQB1＊06：01、DQB1＊05：02、DQB1＊03：02、DQB1＊02：01和DQB1＊06：02；DPA1＊02：02、DPA1＊01：03和DPA1＊D2：01;DPB1＊D5；D1、DPB1＊02：01、DPB1＊13：01、DPB1＊04：01和DPB1＊02：02。这些常见等位基因的频率总和分别占相应位点的75．57％、52．81％、78．28％、62．16％、86．70％、77．23％、95．32％和81．59％。结论中国南方汉族人群的HLAA、B、C、DRB1、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等8个位点的等位基因多态性数据可作为人类学、法医学、移植配型和疾病相关性研究和应用的参考数据。

南方汉族人群HLA-DPA1及-DPB1基因多态性与青光眼睫状体炎综合征的关联研究

目的探讨HLA-DPAl和-DPBl基因多态性与南方汉族人群青光眼睫状体炎综合征（Posner-Sehlossmansyndrome，PSS）的相关性。方法实验组为确诊为PSS的南方汉族患者100例，对照组为南方汉族健康志愿捐血者128名。应用测序分型法对全部血样进行HLA-DPAl和-DPBI基因第2外显子双向测序。用Assign3．5HLA测序分型软件判定等位基因型，比较实验组和对照组HLA-DPAl和-DPBl等位基因及单倍体的频率。结果在实验组及对照组中分别检出6个及4个HLA-DPAl等位基因，实验组HLA-DPAl＊02：01等位基因频率（4．5％）显著低于对照组（12．109％）（χ2=8．124，P=0．004）；实验组及对照组均分别检出16个HLA-DPB1等位基因，实验组HLA-DPB1＊14：01及-DPB1＊17：01等位基因频率均显著低于对照组（DPB1＊14：01：1．00％VS．4．688％，χ2=5．130，P=0．024；DPB1＊17：01：0％vs．2．344％，χ2=3．897，P=0．048）；实验组及对照组DPA1-DPB1单倍体数量分别为23种及25种，实验组DPA1＊02：01-DPBl＊14：01及DPA1＊02：01-DPB1＊17：01单倍体的频率均显著低于对照组。结论DPA1＊02：01-DPB1＊14：01及DPA1＊02：01-DPB1＊17：01单倍体可能为南方汉族人群PSS发病的保护因素。

KIR2DL4基因的多态性与南方汉族白血病的相关性研究

目的探讨南方汉族人群白血病与KIR2DL4等位基因多态性的相关性。方法提取南方汉族急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）（n=283）、急性髓系白血病（acutemyeloid[eukemia，AML）（n=227）、慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CMI。）（n=80）患者和306名南方汉族随机正常志愿捐血者的DNA基因组，应用本实验室自行设计的引物对KIR2DL4基因的全部8个外显子进行测序分型，用Assign4．7分析软件判定基因型。用SPSS13．0统计软件分别对检出的每个KIR2DIA等位基因、10A型等位基因和9A型等位基因的检出比例分别进行差异显著性分析，并进行P值校准（Pc）。结果ALL、AML、CMI，患者和正常对照均检出5种等位基因：KIR2DIA＊001、＊005、＊006、＊008、＊011。ALL病例组与对照组的KIR2DI．4＊011等位基因检出比例、10A型KIR2DL4等位基因检出比例的差异有统计学意义（KIR2DL4＊011：OR=1．66，P=0．01；10A型K琥2DIA：OR=0．42，P=0．03），但尸值经过校准后，差异均无统计学意义（Pc≥O．05）。AML、CML病例组分别与对照组检出的各个KIR2DL4等位基因、10A型等位基因和9A型等位基因的检出比例进行比较，组间比较差异均无统计学意义（P〉0．05、Pc〉0．05）。结论南方汉族ALL、AML、CML白血病与KIR2DL4等位基因多态性无显著关联。

HLA-A、-B、-C、-DRBl和-DQB1等位基因全相合的无关供一受者对的HLA-DPA1和-DPB1基因匹配性研究

目的研究HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1等位基因全相合的无关供-受者对HLA-DPA1和-DPB1基因的匹配性。方法对76对HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1等位基因10／10相合的无关供-受者样本进行HLA～DPA1和-DPB1基因测序分型，从等位基因水平统计和分析HLA-DPA1和-DP通信作者：邓志辉，Emai1：zhihui-deng@sina．cn基因匹配的比例和特点。结果单个HI。A-DPA1、-DPB1基因高分辨水平完全相合的比例分别为17．1％、9．2％，完全相合的比例均较低。HI，A-DPA1等位基因半相合的比例占绝大多数（73．7％），完全不合的比例为9．2％；具有高度多态性的HLA-DPB1基因半相合的比例为57．9％，而完全不合的比例为32．9％。统计HLA-DPA1＋-DPB1等位基因的匹配率，e／4相合的比例最高（51．4％），4／4相合的比例仅为5．6％，而0／4相合的比例为8．3％。结论HLA-A、-B、-C、～DRB1和-DQB1等位基因相合的无关供-受者对HLA-DPA1和-DPB1基因匹配率尚较低，HLA-DPA1和-DPB1基因匹配程度对无关供者造血干细胞移植的影响应引起临床的重视和探讨。

南方汉族KIR-HLA系统基因多态性与慢性髓系白血病的相关性

目的探讨中国南方汉族人群KIR-HLA系统基因多态性与慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的相关性。方法对172份成年CML患者及480份随机正常对照的样本，采用PCR-SSP方法检测K豫基因，用测序分型法进行HLA-A、-B、-C基因分型。从K豫基因及其基因组合型、HLAI类配体、已知的单个KIR4-HLA受一配体组合及KIR-HLA基因型组合等4个层次比较病例组与对照组分子遗传多态性的差异。结果与KIR2DL1配位的HLA-C2、KIR2DL1＋HLA-C2、与KIR3DL1配位的HLA—BBw4—80I的检出频率均显著低于正常对照组，为CML保护因素（HLA-C2：OR=0．386，95％CI：0．240-0．620，P〈0．01；KIR2DL1＋HLA-C2：OR=0．316，95％CI：0．191～0．525，P〈0．01；HLA-BBw4—80I：OR=0．576，95％CI：0．384～0．862，P〈0．01）。HLA-C2及HLA—BBw4—801分子表达机率降低，可能导致与相应的抑制性KIR亲和力的减弱，有利于NK细胞活化。最值得注意的是：KIR-HLA基因型组合ID2（KIRAA1-HLA-C1／C1-Bw6／Bw6-A3／11）在CML组的检出频率显著高于正常对照组，为CML易感因素（OR=2．163，95％CI：1．198～3．906，P〈0．01）。结论本研究识别了KIR-HLA与CML白血病相关的易感或保护性因素，可为CML白血病的发病机制和个体化免疫治疗提供新的线索及理论依据。

HLA测序分型中模棱两可结果的分析及其解决策略

目的探讨无关供-受者器官移植人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）高分辨分型确认实验中，HLA测序分型模棱两可结果的种类、比例及高效解决方法。方法采用美国Atria公司的HLA测序分型试剂盒，对650人份无关供一受者样本的HLA-A、B、C基因第2、3和4外显子，HLA-DRB1第2外显子及HLA—DQB1第2、3外显子进行常规检测，统计常见模棱两可等位基因种类及比例，再应用PCR-序列特异性引物（squeneespecificprimer，PCRSSP）高分辨试剂盒或增加常规检测区外的外显子进行再测序分型（sequencing—basedtyping，SBT），以获得精确的HLA高分辨分型结果。结果650人份供-受者的HLA-A、B、C、DRB1及DQ引基因的直接测序分型出现模棱两可比例分别为76．31％（496／650），91．08％（592／650），97．69％（635／650），88．62％（576／650）和43．38％（141／650）。共发现常规检测区内模棱两可等位基因型组合36种，常规检测区外模棱两可等位基因组合22种。依据中国常见及确认的（common and well-documented，CWD）HLA等位基因表（1．01版），排除罕见等位基因后，共有9种模棱两可CWD组合，除了HLA—B、C位点包括等3种外，其余的3个位点各出现1种；检测区外模棱两可等位基因组合减少为10种，其中HLAA、B位点各1种，HLA-C、-DRB1位点各4种。所有模棱两可结果采用高分辨PCR—SSP或PCR—SBT方法进行必要的复核确认。结论分析了HLA5个位点测序分型中模棱两可结果的常见种类，采用相应的解决策略，可以达到高效、低耗、精确分型的目的。

KIR2DL1框架基因cDNA的分子克隆测序及一个新等位基因的鉴定

目的建立K工R2DLI框架基因cDNA的分子克隆测序方法，并鉴定南方汉族人群一个新的KIR2DL1等位基因。方法对-K豫2DL1框架基因测序分型结果异常的外周血样，提取mRNA，反转录为cDNA，用1对KIR2DLl框架基因特异性PCR引物进行扩增，特异性扩增产物（1．2kb）经切胶回收纯化后，进行分子克隆和单倍型测序。结果KIR2DL1特异性PCR扩增产物，经分子克隆和单倍型测序，检出1个正常的K／R2DL1＊00302等位基因和1个新变异的KIR2DL1等位基因。该新等位基因的序列与KIR2DL1＊00302最相近，但存在编码区nt 188A〉G点突变、位于第4外显子的第42密码子由GAG变成GGG，导致第42位氨基酸残基发生GIu42Gly改变；其序列提交GenBank（序列号：KP025960）和IPD-KIR数据库（IWS40001982），已被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR2DL1＊031。结论我们建立了KIR2DL1框架基因cDNA分子克隆测序方法，在等位基因水平的KIR研究中具有广泛的应用前景。

南方汉族人群KIR2DL4基因的多态性及五个新等位基因的鉴定

目的研究南方汉族人群KIR2DL4基因的遗传多态性。方法采用自行设计的PCR引物对306名南方汉族无关个体K豫2DL4框架基因的8个外显子进行扩增，之后进行双向测序，用Assign3．5软件分析各样本的等位基因型。对与国际IPD-KIR数据库不完全匹配的样本进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果共检出11种KIR2DL4等位基因，其中KIR2DL4＊00503、＊00504、＊032、＊033、＊034被WHOHLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为新等位基因。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DL4＊00102（75．5％）、＊00103（8．2％）、＊00501（34．0％）、＊00503（0．7％）、＊00504（0．7％）、＊00602（14．4％）、＊00801（11．4％）、＊011（22．2％）、＊032（0．3％）、＊033（0．3％）和＊034（0．3％）。第7外显子CDSnt811位置正常的10A型等位基因（KIR2DL4＊00102、＊00103、＊00501、＊00503、＊00504、＊00602、＊032、＊033、＊034）和CDSnt811位置缺失腺嘌呤的9A型等位基因（K琥2DL4＊00801、＊011）的检出比例分别为97．0％及33．0％，约为2．9：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DL4等位基因分子遗传多态性的基础数据，可为移植、生殖免疫、疾病关联研究及人类进化等提供参考。

南方汉族人群功能性KIR框架基因测序分型中模棱两可的结果及解决策略

目的探讨南方汉族人群中功能性KIR框架基因全部编码区测序分型中模棱两可结果的种类及其解决方法。方法对306份南方汉族人群的14个功能性KIR框架基因的全部编码区进行测序分型，统计模棱两可结果的种类及比例，针对每种模棱两可结果中等位基因编码区序列碱基的差异，设计组特异性PCR及测序引物，进行组特异性KIR等位基因PCR扩增和再测序，以鉴定等位基因型别。结果发现KIRZDL5、3DL2和3DL3存在6种模棱两可的结果，种类及其比例依次为：3D阳＊（002，007／010，015）占12．09％（37／306），（2DLSA＊001，2DLSB＊006／2DL5A＊012、2DLSB＊008）占5．88％（18／306），3DL3＊（001，010／009，048）占3．59％（11／306），3DL2＊（007，008／016，027）占2．29o．4（7／306），3DL3＊（00801，048／01001，026）及3DL3＊（00802，048／01002，026）均占1．31％（4／306）。除了（2DL5A＊001，2DL5B＊006／2DLSA＊012，2DL5B＊008）、3DL2＊（007，008／016，027）两组模棱两可结果均分别只检出其中的一种基因型外，其余的4组模棱两可结果每组中均检出了不同的基因型。结论我们建立了有效的组特异性引物扩增和测序方法鉴定模棱两可的结果，在KIR测序分型中具有广泛的应用价值。

中国南方汉族人群KIR2DS4基因的多态性

目的探讨南方汉族人群KIR2DS4分子遗传多态性。方法应用特异性PCR引物扩增306名无关个体KIR2DS4基因的全部外显子，确定KIR2DS4框架基因的有无。对存在KIR2DS4的样本，对该基因的全部外显子进行双向测序，用Assign3．5分析软件鉴定基因型。在测序分型中出现与国际IPD-KIR数据库不完全匹配结果的样本，进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果306名南方汉族无关个体中，携带KIR2DS4基因的个体为297例，经测序分型，均获得了清晰的序列峰图。共检出了7种等位基因，其中3个新等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DS4＊00101（78．8％）、＊003（10．5％）、＊004（16．0％）、＊010（23．2％）、＊017（0．3％）、＊00105（0．3％）和＊018（0．7％），未检出KIR2DS4＊007等位基因。能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊00101、＊017、＊00105）和不能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊003、＊004、＊010、＊018）的检出比例分别为79．4％及50．4％，约为1．6：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DS4等位基因分子遗传多态性，可为移植、疾病关联研究及人类进化等提供基础数据。

人类白细胞抗原新等位基因HLA-C＊01：78的序列鉴定

目的对1例人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）新等位基因进行序列鉴定。方法采用QIAGEN快速DNA抽提试剂盒从外周血样本中提取基因组DNA，PCR方法扩增先证者HLA_C基因的第1外显子至第3内含子和第3内含子-3’非翻译区，PCR产物克隆转染到质粒载体中获得等位基因的单链，对所得克隆子进行第2、3和4外显子双向测序分析。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因，其中一个等位基因为C＊03：04；另一个经BLAST验证为新的等位基因，序列已递交GenBank（KF049216）。与最接近的C＊01：03等位基因序列相比，新等位基因在第2外显子上有1个核苷酸不同，第316位C〉A，导致第82位氨基酸由精氨酸变为丝氨酸（R82S）。结论该等位基因为HLA-C新等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-C＊01：78。先证者的HLA分型结果为A＊02：07，24：02；B＊40：01，46：01；C＊01：78，03：04；DQB1＊05：02，05：02；DRB1＊16：02，16：02。