系统性红斑狼疮的诊断新方法与临床验证

目的验证IFI44L基因甲基化位点作为系统性红斑狼疮(SLE)标志物在临床诊断中的意义,评估采用该方法的试剂盒检测结果的准确性和有效性。方法收集患者外周血标本共136份,经临床诊断,SLE确诊患者标本74份,非SLE患者标本62份。对标本随机编号后,使用SLE基因甲基化检测试剂盒[甲基化特异性高分辨率溶解曲线法(MS-HRM法)]对标本的IFI44L基因甲基化位点进行检测,并根据检测结果区分SLE与非SLE患者标本,标本揭盲后,对结果的灵敏度、特异度、总符合率及一致性系数Kappa值进行评价。结果IFI44L患者结果显示,该方法与临床确诊结果的总符合率为94.85%,灵敏度为93.24%,特异度为96.77%,Kappa值为0.8967。该检测方法与临床确诊方法对于SLE的诊断差异无统计学意义(χ^2=0.133,P>0.05)。结论IFI44L基因甲基化水平可作为诊断SLE及判断SLE病情变化的重要指标。IFI44L基因甲基化位点检测方法是除了SLE传统诊断方法外的另一种有效诊断手段,并从表观遗传学角度提供了SLE发生的证据。

蛋白质芯片检测法在过敏原特异性抗体检测中的应用

目的探讨蛋白质芯片技术诊断过敏性疾病的可行性。方法应用蛋白质芯片方法,将10种常见过敏原抗原集成到活化的玻璃芯片上,并保持蛋白质活性,通过与202例患者标本的反应,同时得到10种过敏项目的检测结果。结果蛋白质芯片法检测结果与对照方法间符合率较高,差异无统计学意义(P>0.05)。结论蛋白质芯片方法可以高通量、即时地检测过敏原血清中IgE的变化,灵敏度达0.5IU/mL,可满足临床上对变态反应性疾病的诊断要求。

伤寒、副伤寒分型诊断蛋白质芯片法的建立和应用

目的探讨应用蛋白质芯片技术诊断伤寒、副伤寒的可行性。方法利用蛋白质芯片方法,将伤寒抗原(To、Th)和副伤寒抗原(Ta、Tb、Tc)及伤寒Vi荚膜多糖抗原集成到已经活化处理的玻璃芯片上,使其保持蛋白质活性和立体结构不变。对86例经血培养确认的已知标本和100例健康体检标本进行检测,并与肥达氏反应作比较。结果蛋白质芯片法检测结果与血培养结果符合率高,灵敏度为97.6%,特异度为98.0%,而肥达氏反应灵敏度为60.4%,特异度98.0%,两方法之间差异有统计学意义(P<0.01)。结论蛋白质芯片法具有高通量、可并行检测伤寒、副伤寒多种抗体的优势,为伤寒、副伤寒的诊断提供了有效手段。

过氧乙酸氧化法检测尿碘水平的方法探讨

目的探讨过氧乙酸氧化法测定尿液中碘水平的方法和技术。方法过氧乙酸氧化法和砷铈催化分光光度法(国标法)平行测定80份尿液样品的含碘量,对测定结果进行相关性分析;用尿碘标准物质及碘标准液分析过氧乙酸氧化法的精密性、线性范围、准确度。结果该方法线性范围5~300μg/L,在此范围内标准曲线的线性相关系数r>0.990;对高、中、低3份碘标准液进行精密性测定,相对偏倚分别为1.5%、2.4%、2.2%;对高、中、低3份尿碘标准物质进行准确度测定,相对偏倚分别为3.9%、2.0%、0.1%;加标回收率测定结果在96.49%~101.25%;维生素C、NaCl、NaBr和胆红素对尿碘标准物质的干扰的相对偏倚分别为2.5%、1.8%、1.5%、2.3%,该法与国标法结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论该法操作简单、标准曲线线性关系良好,准确度高、特异性好、重复性好。

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的利用基因工程方法表达人巨细胞病毒pp65基因片段,并对表达的目的蛋白进行鉴定。方法根据genebank所查的HCMV PP65基因和相关文献选取特异性反应的基因片断,PCR扩增目的基因,将PCR产物切胶回收后与pET-28a载体连接,转化BL21,筛选。对重组质粒进行诱导表达,采用ELISA间接法鉴定纯化的GST/pp65融合蛋白的抗原性进行鉴定。结果目的蛋白经诱导后表达于上清液中,经鉴定目的蛋白具有预期的抗原活性。结论 GST/pp65融合蛋白的获得,为进一步研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型人巨细胞病毒特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础。

人及禽类禽流感病毒蛋白芯片检测方法建立

目的建立可同时检测人及禽类禽流感病毒的蛋白芯片方法。方法采用醛基化玻璃载体蛋白芯片和双位点模式,将禽流感病毒H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2、NP、NS1等9种亚型抗原以最佳浓度,点样于玻璃载体表面,构建相应抗体的检测芯片,分别用于禽类不同类型禽流感病毒血清及随机选择的人血清检测,并对特异性、敏感性及重复性进行测试,与血凝抑制法进行双向验证比较。结果探针H1、H3、H5、N1、N2、NP、NS1亚型抗原的最佳浓度为1 mg/mL,H7、H9亚型抗原最佳浓度为0.5 mg/mL;检测禽类禽流感病毒及人禽流感病毒使用的酶标抗体浓度分别为1∶1 000和1∶1 500;方法具有较好的特异性,对H7N7阳性血清的检测限为1∶40稀释度;重复性检测的变异系数均<2%;血凝抑制法和蛋白芯片法的检测结果一致。结论所建立的蛋白芯片法可用于人类和禽类禽流感病毒的检测。

玻璃载体微阵列芯片法在ENA抗体检测中的应用

为评价以玻璃为载体的微阵列芯片法对ENA抗体检测的灵敏度和特异度,及其在常见自身免疫性疾病中的临床应用价值,我们以免疫印迹法(Western blotting,WB)和以玻璃为载体的微阵列芯片法(Microarray)分别对508例自身免疫性疾病患者和155例健康体检者的血清样本进行了检测,并与WB比较。结果显示:与WB方法相比,玻璃载体微阵列芯片法检测的结果如下:Sm/nRNP灵敏度为98.95%,特异度为99.82%;Sm灵敏度为97.18%,特异度为99.49%;SSA灵敏度为95.29%,特异度为98.73%;SSB灵敏度为96.10%,特异度为99.83%;Scl-70灵敏度为98.48%,特异度为99.66%;PM-Scl灵敏度为100%,特异度为99.49%;Jo-1灵敏度为100%,特异度为99.67%;CENP-B灵敏度为98.39%,特异度为99.67%;PCNA灵敏度为98.33%,特异度为99.83%;dsDNA灵敏度为95.28%,特异度为99.64%;核小体灵敏度为96.70%,特异度为99.30%;组蛋白灵敏度为100%,特异度为98.16%;核糖体P蛋白灵敏度为92.50%,特异度为99.83%;AMA-M2灵敏度为92.31%,特异度为99.67%。从检测结果来看,阳性一致率为97.11%,阴性一致率为99.49%。微阵列芯片法与WB结果具有高度的一致性。用微阵列芯片法可同时检测14项ENA抗体谱,操作简单、速度快、灵敏度高、特异性强,具有完成多种项目同时检测的作用,结果可用仪器和软件来自动判读,值得临床推广应用。

西尼罗热抗体多片段蛋白芯片试剂盒的研制

〔目的〕研制西尼罗病毒(WNV)多片段蛋白芯片IgG抗体检测试剂盒。〔方法〕构建基于WNV的E蛋白、M蛋白及prM蛋白检测的蛋白芯片,并对芯片的抗原点样浓度、芯片检测的特异性、芯片检测的灵敏度以及芯片检测的可靠性进行测定。并利用ELISA法对研制芯片的检测结果进行对比验证。〔结果〕研制芯片的抗原点样最适浓度为E蛋白0.05mg/ml、prM蛋白0.04mg/ml、M蛋白0.2mg/ml;其对M蛋白的检测灵敏度达1.5ng/ml,批内重复检测的CV值≤2%;检测结果的准确性和特异性与ELISA法相比基本一致。〔结论〕本研究建立的西尼罗病毒多片段蛋白芯片的检测法具有较高的敏感性、特异性和可靠性,可用于西尼罗病毒IgG抗体的检测。

人巨细胞病毒UL32和UL44融合基因的表达及其抗原性分析

目的用聚合酶链式反应(PCR)扩增人巨细胞病毒UL32、UL44截短基因,构建pET-32a-UL32-UL44表达载体,转化宿菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,对目的蛋白进行纯化、标记HRP,用于检测IgM抗体。方法根据Gene-bank中HCMV的pp150、pp52蛋白序列,利用Protean计算机软件分析其亲疏水性和抗原性,选取适合的区段,根据其对应的UL32、UL44基因核苷酸序列设计合成引物,PCR扩增目的基因序列,经测序证明无误之后,克隆pET-32a-UL32-UL44重组质粒,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达,纯化目的蛋白,标记HRP,用ELISA捕获法对目的蛋白-HRP标记物的灵敏性和特异性等指标进行评价。结果成功构建pET-32a-UL32-UL44重组质粒,导入在BL21(DE3)菌株中,经诱导后目的蛋白表达于上清中,经纯化、标记HRP,标记物用于ELISA捕获法能够准确、特异地检测HCMV血清标本,80份血清检测结果显示其灵敏度可达92.5%,特异性达97.5%。结论 HCMV基因工程重组蛋白具有较好的免疫活性,为研制以基因工程重组抗原代替传统全病毒抗原的HCMV检测试剂盒打下了基础。

蛋白芯片法在不孕不育抗体检测中的应用

目的评价不孕不育蛋白芯片的临床应用价值。方法用不孕不育蛋白芯片对430份临床标本进行抗精子抗体(ASA)、抗子宫内膜抗体(AEA)、抗心磷脂抗体(ACA)、抗卵巢抗体(AOA)、抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)抗体检测,并与化学发光法(ECLIA)检测结果进行对比。结果蛋白芯片法与ECLIA法的ASA、ACA、AEA和HCG的检测结果具有较好的一致性,但在AOA的检测结果上差异有统计学意义(χ2=4.5,P<0.05)。其中ASA的阳性符合率为91.8%,阴性符合率为98.8%;ACA的阳性符合率为92.1%,阴性符合率为96.0%;AEA的阳性符合率为87.5%,阴性符合率为95.8%;AOA的阳性符合率为79.1%,阴性符合率为98.9%;抗HCG的阳性符合率为90.9%,阴性符合率为98.4%。结论从整体检测结果上来看,不孕不育抗体蛋白芯片联检试剂盒具有操作简便、快速和特异性强等优点,值得在临床上推广使用,但其AOA检测的灵敏度还有待于提高。

微阵列芯片法在抗呼吸道病原体IgM抗体检测中的应用

为评价微阵列芯片法对呼吸道病原体IgM检测的效能及其在诊断近期呼吸道感染中的临床应用价值,以微阵列芯片法(microarray)和ELISA检测1463例疑似呼吸道病毒感染者(病例组)和806例非呼吸道病原体感染者或健康体检者(阴性对照组)的血清样本。结果显示,与ELISA相比,微阵列芯片法检测结果如下:腺病毒(adenovirus,ADV)阳性符合率为94.7%,阴性符合率为97.5%;呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)阳性符合率为94.9%,阴性符合率为97.7%;流感病毒A型(influenza virus type A,IFV-A)阳性符合率为95.3%,阴性符合率为97.9%;流感病毒B型(influenza virus type B,IFV-B)阳性符合率为93.3%,阴性符合率为97.9%;副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)阳性符合率为93.3%,阴性符合率为97.4%;肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)阳性符合率为94.0%,阴性符合率为98.0%;肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae,CP)阳性符合率为93.6%,阴性符合率为97.3%。微阵列芯片法与ELISA检测急性感染期患者的阳性符合率分别为91.2%、90.3%、86.8%、88.9%、93.5%、93.8%和93.8%。由此,微阵列芯片法与ELISA结果相比具有较高的符合率。使用该方法可一次检测血清样本中7种呼吸道病原体的IgM滴度,具有操作简便、通量高、灵敏度、特异度高等优点,对近期呼吸道病原体感染的诊断和鉴别诊断有重要参考价值,值得临床推广。