结直肠癌中miR-200家族启动子甲基化状态分析

目的检测HCT116、HT29、LS174t、SW480、SW620和LoVo细胞中miR-200家族启动子甲基化状态,分析其与结直肠癌临床分期、分化程度及预后的相关性;同时进行miR-200家族甲基化程度与患者生存相关性分析。方法重亚硫酸盐测序法(bisulfite genomic sequence PCR,BSP)检测6株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR-200家族启动子甲基化程度;分析其甲基化程度与细胞恶性程度、miR-200a表达量的相关性。甲基化特异性(methylationspecific PCR,MSP)技术检测138例结直肠癌组织中miR-200家族启动子甲基化程度。结果 6株不同恶性程度的结直肠癌细胞株中miR-200家族启动子甲基化程度不同,且其甲基化程度与细胞恶性程度成反比,与细胞株中miR-200a表达量的检测结果一致。结直肠癌组织中miR-200家族启动子甲基化程度与患者年龄无关,与患者性别、肿瘤最大径、淋巴结转移及远处转移、患者术后生存时间相关。结论 miR-200家族的表达受甲基化修饰的调控,且该调控成为影响表达量的主要原因。miR-200家族甲基化程度与结直肠癌患者生存期密切相关,可作为预后指标。

人Kin17蛋白的原核表达及纯化

目的:构建重组质粒,在原核系统中表达带His标签的人Kin17融合蛋白,并对表达产物进行纯化及鉴定。方法:以PK3质粒为模板,PCR扩增出全长的KIN17基因,并将PCR产物插入到原核表达载体pET32a中,构建的重组质粒经BamHⅠ/HindⅢ双酶切及DNA测序方法鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,并用丙基-β-硫代半乳糖苷诱导表达His-Kin17融合蛋白,最后应用Ni-NTA柱亲和层析方法来纯化融合蛋白及经Western免疫印迹鉴定纯化的重组蛋白。结果:双酶切及DNA测序方法证实pET32a-KIN17质粒构建正确,融合蛋白经诱导表达、纯化、鉴定后,得到纯度达到95%以上的His-Kin17重组蛋白。结论:成功构建携带KIN17基因的重组载体,并获得了高纯度的His-Kin17重组蛋白,为深入研究Kin17蛋白的分子结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。