细胞核骨架蛋白Lamin A对细胞命运的调控和机制研究

目的Lamin A作为细胞核骨架蛋白,由基因LMNA编码,是外界机械力刺激的细胞核内响应器。研究显示Lamin A在组织硬度较高的细胞和分化程度较高的细胞中高表达,而在较软的组织和细胞中表达量较低。本研究期待阐释调控Lamin A是否能直接诱导细胞命运转化及相关机制。方法通过课题组开发的细胞核力学FRET荧光探针来分析细胞核硬度,通过RNA-seq、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光以及CUT&Tag等实验研究细胞命运和机制。结果发现敲除成肌细胞或者成纤维细胞中LMNA后细胞和细胞核均变软,发现敲除LMNA后细胞中高表达神经相关基因,并且H3K9me2、H3K9me3标记的异染色质区域解散,H3K9me2在核周的富集减少,H3K9me3斑点变小变多。同时,视磺酸处理同样可调控核周异染色质下降和细胞命运改变。为了验证视磺酸调控染色质分布的机制,通过FHA2与全长Lamin A构建Lamin A磷酸化的FRET探针,结果显示视磺酸能调控Lamin A磷酸化参与细胞命运调控。结论本研究揭示了调控Lamin A表达和修饰能促进细胞命运转化及其表观遗传调控机制,对于再生医学有着重要的意义。

震荡流促进内皮细胞炎症的染色质调控机制

目的以内皮细胞炎症为主要特征的动脉粥样硬化(AS)好发于血管的弯曲和分叉等震荡剪切应力(OSS)区域。课题组前期研究发现震荡剪切应力通过上调血管内皮细胞中应激颗粒关键蛋白G3BP2表达和应激颗粒形成介导内皮炎症,本研究主要是为了揭示应激颗粒调控内皮炎症的机制。方法使用微流控和平板流动腔系统进行力学加载,使用免疫荧光,活细胞实时示踪染色质等方法。结果首先发现震荡剪切应力促进内皮细胞细胞核变小,基于团队开发的细胞核力学检测FRET探针,发现震荡剪切应力降低细胞核的力学传递。随后对测序结果分析,发现调控染色质相关酶的表达改变显著,通过建立H2B和H3K9me2/3标记染色质和异染色质的稳定细胞株,利用超分辨显微镜观察EC染色质重排过程,结果显示异染色质快速下降,并且向核质扩散,引起染色质重排。进一步通过构建G3BP2敲除和过表达系统,研究应激颗粒对内皮细胞异染色质重排的机制,发现应激颗粒能调控染色质重排和内皮细胞炎症。结论本研究从无膜细胞器与细胞核合作的角度揭示了震荡剪切应力应激介导内皮炎症的新机制,有助于为血管病变提供临床诊断和防治的新思路。

仿生SUN力传递的活细胞核张力FRET探针开发与应用

目的细胞核力学在生理和病理过程中发挥至关重要的作用,细胞核力学却难以测量。为此,本研究的目的在于开发一种能用于定量和可视化活细胞核力学传递的工具。方法根据FRET生物探针的设计原理,以公认的负责力学传递的LINC复合物中SUN蛋白为模型分子,开发了一种基于FRET的细胞核张力传感器(Nuclear Tension Sensor,Nu TS)。随后验证了Nu TS对细胞收缩性、LINC复合物完整性、ECM硬度以及细胞核形变(整体和局部)的响应,并利用Nu TS考察了细胞铺展、细胞核变形、细胞迁移以及胚胎发育或组织成熟过程中的细胞核力学特性。结果细胞收缩性降低可以减小细胞核受力,完整的LINC复合物有利于细胞核受力;与软基底相比,细胞核在硬基底表面受力更大;高渗条件使细胞核受力降低而低渗条件使细胞核受力增加;Nu TS对局部力学刺激过程中细胞核力学变化也具有快速而灵敏的响应。细胞核受力在细胞黏附铺展过程中会逐渐增大;而在细胞迁移过程中,相对于尾端,细胞核前端受力更大。体内实验表明,在斑马鱼胚胎中,不同部位的脊索组织及其成熟过程均呈现不同的细胞核力学特性。结论本研究开发的Nu TS可以快速灵敏地测量和动态可视化细胞核力学变化,为监测生理或病理过程中细胞核力学变化提供了一种可能。

基底刚度调控的组蛋白修饰和染色质重构

目的探究基底刚度调控组蛋白修饰与染色质重构的动态变化规律和相应机制.方法基于荧光共振能量转移(FRET)技术,开发并表征具有高灵敏度和高特异性的FRET探针,用于组蛋白甲基化及核纤层蛋白磷酸化的活细胞成像。针对不同种类的细胞制备不同基底刚度的PAA水凝胶,FRET活细胞影像对不同基底刚度和时间点的核纤层蛋白磷酸化及组蛋白修饰进行实时动态研究。进一步采用蛋白免疫沉淀和磷酸化蛋白质谱筛选磷酸化的核纤层蛋白和染色质结合蛋白。