马鼻肺炎双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立快速、准确检测马疱疹病毒1型(EHV1)和4型(EHV4)的双重荧光定量PCR检测方法。【方法】以EHV1、EHV4的全基因组序列为基础,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,分别设计EHV1与EHV4特异性引物和探针,筛选引物,优化反应条件,分型检测马疱疹病毒(EHV1、EHV4)。【结果】检测到EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ和EIAV标准毒株,EHV1、EHV4为阳性结果,其余病毒为阴性结果;EHV1、EHV4DNA模板的最低检出限为1.47×10^2copies/μL;检测64份临床样本,阳性检出率为14.06%,病毒分离证实100%符合。【结论】双重荧光定量PCR检测方法可直接应用于检测并区分EHV1、EHV4,并可在短时间内获得对EHV1/EHV4特异性及敏感性的检测结果。

高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫的初步研究

目的 利用实时荧光PCR及高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。 方法 针对广州管圆线虫核糖体RNA基因的内转录间隔区（ITS）序列设计引物，应用实时荧光PCR和高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。并通过检测广州管圆线虫、华支睾吸虫和棘颚口线虫DNA，分析该方法的特异性；分别检测1~10条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA，分析该方法的敏感性。 结果 该方法能够特异性检测广州管圆线虫幼虫，检测华支睾吸虫和棘颚口线虫时未出现扩增曲线和熔解曲线峰。检测灵敏度可达到1条幼虫。 结论 实时荧光PCR及高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫具有较好的特异性和敏感性。

口蹄疫病毒直接实时荧光RT-qPCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因保守序列,设计出1对口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特异性探针FMD-Pb序列,建立了一种简便、快速、高效的口蹄疫病的直接实时荧光RT-qPCR(dRT-qPCR)检测方法。结果表明,在特异性方面,对口蹄疫病毒7个血清型的检出率100%;在灵敏度方面,其与常规提取RNA方法对比,阳性检出率差别很小;在对133份未知样本检测方面,dRT-qPCR方法检出阳性88份,常规方法检出阳性84份。dRT-qPCR方法的检测结果更可靠,适于对大量样本进行检测。

马流感H3N8实时荧光RT-PCR检测方法的建立

通过比对NCBI上马流感H3N8序列,针对HA和NA基因序列高度保守区域设计了特异性强的引物与探针,优化了程序,建立了以实时荧光RT-PCR技术检测马流感H3N8的方法。结果表明,该方法最小检测浓度为3.36×10^2copies/μL;特异性强,仅针对马流感H3N8样本检出为阳性;对58份临床样本的检测,阳性检出率为12.07%,是常规PCR的2.3倍,且与病毒分离100%符合。

鹦鹉热衣原体荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立鹦鹉热衣原体的荧光定量PCR检测方法。方法:根据鹦鹉热衣原体incA基因序列设计高特异性、高保守性的引物和Taqman-MGB探针,通过灵敏度、特异性、重复性研究以及临床样本验证,建立鹦鹉热衣原体的荧光定量PCR检测方法,并与WOAH推荐的鹦鹉热PCR检测方法进行比较。结果:本方法对鹦鹉热衣原体检测均为阳性,对沙眼衣原体、流产衣原体、禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的扩增均为阴性;本方法的最低检测浓度为51.2copies/μL,扩增效率为95.79%;本方法的重复性变异系数为0.26%~0.69%;对临床样本检测结果对比WOAH推荐方法,Kappa值为0.904,具有较强的一致性。结论:本研究建立的鹦鹉热衣原体荧光定量PCR检测方法稳定性好、特异性强以及灵敏度高,可应用于鹦鹉热的临床诊断与流行病学研究等工作中。

肠道病毒71型免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立肠道病毒71型(EV 71型)免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法。方法根据EV 71型VP1基因保守序列设计高特异性、高保守性的引物和探针,运用设计序列和缓冲液建立一种免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果本研究建立的方法能够检测出EV 71型病毒株和EV 71型核酸标准品,而对柯萨奇病毒A4、A6、A10、A24型和诺如病毒、肠道腺病毒、札如病毒、麻疹病毒、风疹病毒的扩增均为阴性,阴性对照结果中无非特异性扩增和无假阳性结果。灵敏度检测结果显示,对EV 71型核酸标准品最低检测浓度为6.13×102copies/μL,灵敏度标准曲线为y=-3.329 8x+41.571(r=0.999 4)。对临床样本检测结果显示,本研究方法与传统RT-PCR检测方法检测结果的Kappa值为0.82,一致性强度等级为最强。结论本研究建立的EV 71型免提取核酸荧光RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,适用于EV 71型的临床样本筛选分析。