气相色谱-质谱联用检测尿液8种有机酸实验室间质量的调查

目的评价2018年遗传代谢病气相色谱-质谱联用检测尿液有机酸实验室间质量调查结果,以改进和提高新生儿遗传代谢病筛查或相关实验室气相色谱-质谱联用检测质量。方法 2018年3月向全国19家开展气相色谱-质谱联用尿液有机酸检测的实验室发放2个批号质控尿液样品(批号201811和201812)。实验室自愿参加此次调查活动并按照规定格式上报结果、测定方法、仪器和试剂等相关信息。组织者用Clinet EQA程序和Microsoft Excel 2010等软件分析各实验室检测结果及检验前、检验中及检验后过程。结果实验室回报率为94.7%(18/19)。2个批号样品(批号201811和批号201812)的检测中,各参加实验室部分有机酸的检测结果相对稳定;相比高浓度而言,低浓度有机酸的检测水平相对较好。质控品稳定性检测结果显示,苯丙酮酸(稳健变异系数99.48%)和尿黑酸(稳健变异系数67.56%)的结果差异较大。结论相比高浓度,低浓度有机酸的检测水平相对较好;稳定性差的苯丙酮酸和尿黑酸不适合作为室间质量评价质控品,应选用更稳定的化合物作为质控品以评价实验室质量。

深圳市光明区24564例新生儿耳聋基因筛查结果分析

目的对深圳市光明区所属3家医院新生儿耳聋基因检测结果进行分析,了解深圳光明区新生儿耳聋基因的致病突变分布情况,为不同致病原因的耳聋早期干预提供指导。方法针对深圳市光明区2019年4月至2021年12月的24564例新生儿,运用飞行时间质谱技术检测主要耳聋致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4、12S rDNA的20个致病突变位点,分析本地区新生儿遗传性耳聋基因突变位点分布情况。结果24564例新生儿中,筛查出携带致病耳聋基因947例,总体携带率3.86%。其中GJB2基因482例,未检出167del T突变,携带率1.965%;GJB3基因62例,携带率0.252%;SLC26A4基因340例,携带率1.386%;线粒体12S rRNA基因63例,携带率0.256%。结论深圳市光明区新生儿遗传性耳聋基因突变率较全国平均水平低,GJB2基因和SLC26A4基因是最常见的基因突变类型,与2017~2018年筛查数据相比,主要突变位点携带率有所下降,提示早发现、早干预可减少耳聋的发生。

新生儿筛查C5-OH异常确诊2例3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症

目的探讨新生儿筛查3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)异常联合尿有机酸、基因突变检测进行疾病鉴别诊断。方法选取2019年10月至2022年9月在中国科学院大学深圳医院(光明)进行遗传代谢病筛查的14例初筛3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)浓度高于阳性临界值(0.45μmol/L)的新生儿为研究对象;初筛采用串联质谱法,辅助及鉴别诊断使用气相色谱-质谱联用法和高通量测序技术检测基因突变,结合随访资料进行临床诊断。结果根据14例新生儿的实验室检测结果并结合随访资料临床诊断出2例无症状3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(MCCD)新生儿。其中1例行尿有机酸检测发现3-羟基异戊酸(171.45μmol/L),3-甲基巴豆酰甘氨酸(43.08μmol/L)含量升高;行基因突变检测时在MCCC2基因中发现2个意义未明杂合突变(5:70898419*,NM_022132.4,c.470A>G;5:70939676*,NM_022132.4,c.1103G>A);另1例行基因突变检测时在MCCC1基因中发现1个致病杂合变异(3:182755082,NM_020166.3,c.1518delG)和1个意义未明的杂合变异(3:182817330*,NM_020166.3,c.-102C>T)。结论C5-OH异常提示多种遗传代谢病,但需联合尿液有机酸、基因检测等技术进行鉴别诊断。

深圳市3891例患者珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果分析

目的深圳地区珠蛋白生成障碍性贫血基因型分布特征及基因频率。方法选择2016年12月至2019年12月在中国科学院大学深圳医院(光明)医学实验中心进行珠蛋白生成障碍性贫血基因检测的患者3891例。应用膜条导流杂交技术一次性检测患者携带的珠蛋白生成障碍性贫血基因。结果在3891例研究对象中检出珠蛋白生成障碍性贫血基因变异1910例,占比49.09%;其中α-珠蛋白生成障碍性贫血1135例(29.17%),β-珠蛋白生成障碍性贫血697例(17.91%),αβ-复合型珠蛋白生成障碍性贫血78例(2.00%)。结论深圳地区珠蛋白生成障碍性贫血发病率高,其基因型分布特征和频率可为深圳地区珠蛋白生成障碍性贫血研究提供数据支撑。

小儿尿液中的新蝶呤及生物蝶呤检测方法优化

目的基于高效液相色谱法(HPLC)同时检测小儿尿液中新蝶呤(N,CAS No:2009-64-5)和生物蝶呤(B,CAS:22150-76-1)的含量并探究KI-I氧化的条件。方法采用KI-I2法氧化原型新蝶呤及生物蝶呤,在激发波长为350 nm,发射波长460 nm下使用HPLC进行检测,其中色谱柱选用Kromasil EternityXT C18(4.6*250mm,5μm),流动相为甲醇:水(10:90)。结果新蝶呤及生物蝶呤的线性均在0.9999以上,检测范围为新蝶呤:0.00625mg/mL~1.0mg/mL,生物蝶呤:0.00675 mg/mL~1.08 mg/mL,加标回收率在92.18%~98.24%。氧化过程中,普通实验室的光照对实验无明显的影响,氧化前不酸化尿液会造成测量的N、B值减小。结论使用优化方法检测小儿尿液中的新蝶呤、生物蝶呤与尿肌酐的含量比值,并通过计算B%(百分比),有助于高苯丙氨酸的鉴别分型,对患儿的治疗及预防发病具有重要意义。

心肌细胞增殖影响因素分析

心血管疾病是全球死亡的主要原因,其中心力衰竭和急性心肌梗死占比最高。成人的心脏受损后无法再生是阻碍心血管疾病疗效的重要因素。近几年,研究发现通过控制心肌细胞的去分化和增殖能促进心脏再生,为治疗心血管疾病提供了潜在的靶点。因此,了解心肌细胞去分化和增殖的调控机制,寻找促进方法成为心脏再生研究领域的热点。在这里,我们回顾了心肌细胞增殖的方式,简述了影响心肌细胞增殖的因素,探讨了当下心肌细胞增殖研究领域的进展。

采用Excel电子表格制作新生儿血液氨基酸及肉碱谱项目室内质控图

目的探讨利用Excel电子表格制作新生儿血液氨基酸及肉碱谱项目室内质控图的方法。方法使用Excel表格的作图功能及VB代码编辑功能,设计制作出包括失控点在内的单值多点的定量质控图。结果将靶值、1SD 值及当前批次质控数据输入数据表中,计算机可依据所有测定点绘制成质控图,图中的失控点与在控点区分明显,便于判定。结论利用Excel表格的强大功能制作适用于新生儿血液氨基酸及肉碱谱室内项目质控图,方便且实用,对保证检验结果可靠性具有重要意义。

滤纸干血斑用于脊髓性肌萎缩症基因筛查方法的建立

目的建立滤纸干血斑基因组DNA自动化提取方法及流程,并探索其在脊髓性肌萎缩症(SMA)基因筛查中的应用。方法收集45份干血斑标本,采用打孔钳打孔后提取DNA,使用多重PCR结合荧光探针技术进行SMN1检测,考察最低起始干血斑用量。收集103份4℃不同保存时长的新生儿干血斑和17份EDTA抗凝血制备的干血斑,使用最低起始量提取DNA并检测SMN1,考察运输与保存条件对基因检测结果稳定性的影响。结果最低1片直径4mm的干血斑所提取的DNA浓度2.54~5.71ng/μL、纯度1.676~1.984,可满足SMN1检测要求。4℃避光保存1~24个月的新生儿干血斑标本,新鲜采集并经冷链运输48~72h的EDTA抗凝血及-80℃超低温冷冻保存1~2年的EDTA抗凝血制备的干血斑标本均可稳定检出SMA基因型。结论1片直径4mm的干血斑即可满足SMN1检测要求,大大降低了样本采集、保存和运输的难度和复杂程度,有利于开展大规模人群筛查,为现有新生儿筛查体系下增加SMA筛查提供了技术基础。

自制吹干装置在滤纸干血片样本制备中的应用

目的探讨自制吹干装置在滤纸干血片样本制备中的应用价值。方法将50μL全血滴在直径为12 mm的滤纸片上,分别以自然晾干和自制吹干装置干燥2种方式干燥血片。记录不同实验条件下血片干燥状态随时间变化的情况。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测滤纸干血片样本中8种氨基酸和15种酰基肉碱水平,比较不同打孔部位[中心及周边部位(左上、右上、左下、右下)]之间检测结果的差异和不同干燥方式之间检测结果的差异,同时评价精密度和准确性。结果在室温(23±2)℃、湿度60%±5%的条件下,自然晾干和采用吹干装置使血片达到完全干燥的时间分别为95和40 min;但在室温(23±2)℃、湿度80%±5%的条件下,2种干燥方式使血片达到完全干燥的时间均为115 min。2种干燥方式周边打孔与中央打孔取样的检测结果比较,除自然干燥方式中辛酰肉碱(C8)的差异为-15.51%、3-羟基棕榈烯酰肉碱(C16-OH)的差异为-19.23%、即刻用吹干装置干燥方式中C16-OH的差异为-16.67%外,其他项目的差异为-14.81%~14.61%。不同干燥方式下氨基酸和肉碱的变异系数(CV)为2.85%~21.98%、准确度为97.08%~118.18%,均符合要求。结论自制吹干装置可有效提高血片的干燥效率,且不会对氨基酸和酰基肉碱的检测结果造成影响,可用于滤纸干血片的制备。

基于气相色谱-质谱的尿液代谢组学技术结合化学计量学用于戊二酸血症Ⅰ型早期检测研究

采用气相色谱-质谱联用技术结合化学计量学,针对高维小样本的疾病代谢组学图谱建立高性能的戊二酸血症Ⅰ型(GA-Ⅰ)早期检测模型。基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的共线性处理和数据解释优势,自助抽样法(Bootstrap)通过数据扰动方式集成多个模型的变量选择能力,挑选出能够持续被筛选的变量实现稳健特征筛选(BS-PLSDA)。对于GA-Ⅰ的尿液代谢组学图谱,在两种逐步增大训练集之间样本差异的比例划分(7:3和6:4)下,载荷(LW)、变量投影重要性(VIP)、显著性多元相关(sMC)3种信息向量对应的BS-PLSDA均优于其单独PLS-DA建模的特征变量筛选稳健性。在样本划分比例为7:3时,BS-VIP-PLSDA的Kuncheva指数高达0.807 5。筛选出的稳健特征变量与文献报道的诊断指标一致,不仅真正解释组别间的差异与GA-Ⅰ的代谢机理密切相关,且BS-LW-PLSDA、BS-VIP-PLSDA和BS-sMC-PLSDA展示了良好的预测性能,受试者工作特征曲线下面积均值分别为0.773 9、0.854 8和0.847 1,马修斯相关系数均值分别为0.671 9、0.783 8和0.801 3。与支持向量机递归特征消除法(SVM-RFE)相比,在采用相同的集成特征选择策略下,尽管非线性径向基核函数对应的BS-RBF-SVMRFE可获得高建模性能,但数据解释能力较低。该研究提出的BS-PLSDA可兼顾建模性能和模型解释能力,符合实际临床需求,对GA-Ⅰ早期检测、辅助诊断和疾病机理研究具有很好的指导意义。

1例短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的诊断分析

目的探讨中国辽宁朝阳地区1例短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(SCADD)患儿的临床特征及基因突变特点。方法利用串联质谱技术检测27147名新生儿干血斑滤纸片中酰基肉碱水平,然后通过尿有机酸检测、及短链酰基辅酶A脱氢酶(ACADS)基因检测对筛查出的1例疑似SCADD患儿进行确诊。结果确诊1例SCADD患儿。出生后因黄疸和严重病毒性感染接受治疗。串联质谱检测显示丁酰肉碱(C4)及其与乙酰肉碱(C2)、丙酰肉碱(C3)比值增高,提示异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症,乙基丙二酸脑病,短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症可能。尿有机酸谱显示乙基丙二酸(EMA)增高(37.14(0.00-7.45)),排除异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症。基因检测可见患儿ACADS基因两个罕见突变c.164C>T/c.431C>T,其中164C>T为确知的致病变异。c.431C>T暂定级为意义未明,后通过父母基因验证可知两个变异构成复合杂合,根据ACMG PM3证据将其升级为疑似致病变异。据此患儿确诊为短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症。对患儿行药物及食物辅助,母亲进行爱乐维或金施尔康补充。3个月后复诊,患儿出现明显改善。结论通过血串联质谱筛查配合尿有机酸检测和基因测定可以对SCADD精确诊断。案例中SCADD患者携带的意义未明突变获得PM3证据升级为疑似致病突变具有一定的临床参考意义。

深圳市光明区新生儿耳聋基因筛查结果分析

目的分析深圳市光明区所属3家医院出生的新生儿耳聋基因检测结果,以了解深圳光明区新生儿耳聋基因的突变携带情况。方法采集深圳市光明区2017年5月~2018年11月出生的新生儿足跟血16249份,用PCR+导流杂交法检测中国人群中常见的4个耳聋易感基因(GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrDNA),其中2017年5月~2018年3月收集的标本检测4个常见耳聋基因的9个突变位点,2018年3~11月收集的标本检测4个常见基因的15个突变位点,分析新生儿遗传性耳聋基因突变携带率及突变位点分布情况。结果16249名新生儿中,检出携带突变耳聋基因575例,总阳性率3.53%,其中检测4基因9位点样本数为8448例,突变样本为262例,突变率为3.10%;检测4基因15位点样本数为7801例,突变样本为313例,突变率为4.01%。所有突变基因中,GJB2基因(1.96%)和SLC26A4基因的突变率最高(1.21%)。结论深圳市光明区新生儿遗传性耳聋基因突变率低于全国平均水平,基因突变主要以GJB2基因、SLC26A4基因为主,扩大基因位点数量的检测有利于降低漏筛率;早发现、早干预可减少耳聋的发生。