小分子干扰核糖核酸转染小鼠成骨细胞的效率研究

目的研究直接转染化学合成小分子干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNA)和通过质粒转导后在细胞内合成siRNA两种方法转染小鼠成骨细胞的转染效率,并优化实验条件。方法从无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)级BALB/c新生鼠取材进行成骨细胞原代培养,经碱性磷酸酶(alkaline phospha-tase,ALP)和矿化结节检测鉴定为成骨细胞后传代至第3代,接种至24孔培养板。使用化学合成的经羧基荧光素标记的siRNA和带绿色荧光蛋白基因的质粒分别转染小鼠成骨细胞,在实验中改变siRNA和脂质体的用量,并改变转染时的细胞密度,通过荧光显微镜检测转染效率。同时,使用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的转染试剂的细胞毒性。结果使用化学合成的siRNA转染原代培养的小鼠成骨细胞获得了较高的转染效率,其最大值达到90%以上,与质粒的转染效率相比有很大提高,且其细胞毒性在可接受的范围内。结论使用化学合成的siRNA转染原代培养的小鼠成骨细胞可以获得较高的转染效率,是一种理想的实验方法。

siRNA沉默小鼠原代成骨细胞LIMK2基因的实验研究

目的探讨采用RNA干扰抑制原代成骨细胞中LIMK2的表达及其抑制效率,为进一步研究LIMK2基因的作用奠定基础。方法针对小鼠LIMK2基因,化学合成3条siRNA,分别编号为R1、R2、R3,用脂质体分别介导转染到小鼠原代成骨细胞中,转染后24、48h提取细胞的总RNA和总蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,研究3条siRNA在不同时间点对LIMK2基因的抑制效率。结果RT-PCR结果显示编号为R3的siRNA对LIMK2mRNA表达的抑制效率最高,两组应用R3siRNA后的LIMK2 mRNA表达量分别为对照组的19.30%(转染后24h)、18.63%(转染后48h);Westernblot检测显示编码为R3的siRNA对LIMK2蛋白表达的抑制效果最明显,两组应用R3siRNA的LIMK2蛋白表达量分别仅为空白对照组的1.32%(转染后24h)、1.19%(转染后48h)。结论编号为R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达。