工业酶催化剂构建与反应过程强化新技术

酶催化由于温和条件下的高选择性推动了化学工业可持续发展。然而,稳定性差和催化反应类型匮乏是天然酶在实际工业应用中面临的两大关键挑战。近年来,随着化工、生物、化学和材料等领域的深度融合,开发高稳定、高重复使用性的固定化酶和构建拓展催化反应类型的酶金属复合催化剂,分别为解决酶催化实际工业应用中稳定性差和催化反应类型受限的问题提供了新的方案。本文主要综述近年来在构建固定化酶和酶金属复合催化剂领域取得的一些进展,重点介绍酶纳米凝胶、酶无机纳米晶体复合物和酶金属复合催化剂方面的研究进展,并探讨该领域在未来发展中所面临的问题与挑战。

UDP-糖基转移酶GmSGT2催化金盏花苷E的半乳糖基修饰

通过qPCR从大豆cDNA文库克隆得到UDP-糖基转移酶GmSGT2的基因,构建工程菌株E.coli BL21/pET28a-GmSGT2,通过His-tag标签法得到纯化的GmSGT2,探究GmSGT2底物特异性,考察pH、温度对GmSGT2的影响,测定其催化金盏花苷E的动力学常数,通过分子对接阐明GmSGT2的底物识别机制。结果表明:GmSGT2可将1分子半乳糖转移到金盏花苷E糖上的C2位置,实现糖上加糖。除UDP-半乳糖外,GmSGT2还可识别UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-阿拉伯糖,相对酶活为24.67%~37.60%。GmSGT2催化金盏花苷E的最适温度为40℃,最适pH为7.5,催化效率k_(cat)/K_m为2.71 L/(mmol·s)。分子对接结果表明,His20是GmSGT2的催化氨基酸,Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391参与识别底物。GmSGT2催化金盏花苷E半乳糖苷化的研究为酶法合成半乳糖苷衍生物提供指导意义。

转录因子在微生物细胞工厂构建中的应用

利用微生物作为底盘构建细胞工厂进行绿色可持续的生产已经成为当前备受关注的新型环保生产方式。随着合成生物学的发展,微生物细胞工厂的高效、“智能化”生产成为新的研究热点。微生物高效合成目的产物离不开代谢途径的调控与优化,而转录因子作为常见的调控元件,在构建微生物细胞工厂中发挥着重要的作用。同时,转录因子在生物传感器、高通量筛选及底盘细胞改造等方面有着广泛的应用。基于此,从转录因子的调控机制出发,本文综述了转录因子的挖掘、预测与鉴定方法,并对转录因子在微生物细胞工厂构建中的应用进行全面的总结与讨论,以期为相关的研究提供参考。

酶复合催化剂原位合成新方法及生物催化应用

工业生物催化面临两大重要挑战,一是可工业应用的酶催化反应类型仍然比较有限,远少于化学催化剂,因此需要拓展酶催化的反应类型;二是酶在苛刻的工业催化反应条件下尤其是在高温、有机溶剂、不适宜的pH等环境下稳定性较差,因此需要提高工业酶催化剂的稳定性.研究者己经开发了很多方法,以解决这两方面难题,例如酶的定向进化、定点突变、酶的计算机从头设计和构建人工金属酶等.本文系统介绍了本课题组开发的酶复合催化剂原位合成方法及其生物催化应用,期望为解决工业生物催化的上述挑战提供新思路.原位合成是构建酶-无机晶体复合催化剂的一种简便、高效、普适的方法.酶-无机晶体复合物中,限域包埋使酶具有高于常规固定化酶的催化活性和稳定性.该方法可以简便拓展至其它多种类型的无机晶体材料,显著提高酶的稳定性.无机晶体的限域包埋对酶分子结构和性能有着重要影响,通过理性设计复合催化剂的结构,可实现对酶的活性、稳定性以及多酶反应级联效率的有效调控.本课题组采用分子模拟和实验相结合的方法阐释了多酶-无机晶体复合催化剂所驱动的级联反应效率提高的关键因素.通过调控原位合成中金属离子和有机配体的浓度,实现了酶分子在缺陷型甚至无定形载体中的包埋.在此基础上,深入探讨了缺陷对酶分子结构和催化活性的调控机制,为酶复合催化剂的理性设计提供了依据.同样基于原位合成方法,本课题组构建了酶-金属团簇复合催化剂,实现了温和条件下酶催化和金属催化的高效耦合和协同.以脂肪酶-锂团簇复合催化剂为例,阐明了酶-金属团簇复合催化剂中二者相互作用对酶分子结构和活性以及金属催化活性的影响机制,为酶催化和金属催化相融合的研究提供了重要基础.我们对这-领域存在的挑战和未来重要的研究方向也进行了讨论,希望本文可以从催化剂工程角度为高效酶催化剂的设计以及生物催化应用领域的拓展提供新思路,推动该领域发展.

点击化学作为分子连接工具:机遇与挑战

2022年诺贝尔化学奖授予点击化学以及生物正交化学领域的三位科学家,显示了点击化学在当代合成领域的重要地位.点击化学本质是一类连接反应,旨在通过将不同单元分子高效地拼接在一起,最终得到具有特定结构与功能的分子.在传统有机化学中,碳碳键的合成通常具有较大难度,因为它们涉及较低的化学驱动力和较多的副反应.点击化学强调开发基于碳杂原子键的新型组合化学反应,并通过这些反应简单有效地获得多样性分子.点击化学的发展将科学家们从复杂、专业性强的有机合成中解放出来,使他们可以专注于分子功能的开发,一定程度拓宽了合成化学的应用范围.基于点击化学的优越性能,其在聚合物合成以及生物医学等领域表现出了非常广泛的应用前景.本文简要概述了几种涉及不同底物和催化剂类型的典型点击反应,并尝试解释这一领域背后的发展逻辑.此外,阐述了点击化学在现代科学,尤其是聚合物合成和生命科学等领域的应用,及其目前存在的局限性和未来可能的发展方向.点击反应的主要特征包括产率高、选择性好、副产物无害且易分离、反应条件简单、原料易得、符合原子经济性和应用范围广等.典型的点击化学包括亲核开环反应、环加成反应、保护基反应、碳碳多键加成反应和施陶丁格反应等,这些反应大多在点击化学概念提出之前就已被开发.通过改变反应条件,选择合适的底物和催化剂,这些反应可以更加满足点击标准.而随着点击化学在生命科学领域的应用,不依赖于催化剂的反应逐渐受到重视,因为他们更有希望在生物体内保持点击活性.环应力可以在无催化剂存在下有效改善反应动力学,针对底物分子应力的研究成为了点击化学领域的重点.此外,近年来光催化点击反应和解离反应也受到广泛关注,这些“智能”点击反应可以提供有效的时空控制、可逆的连接-释放过程,代表了点击化学新的突破.在应用方面,点击化学可以提供高原子经济性的分子合成方法,因而被广泛用于聚合物的合成,它也为聚合物的功能修饰提供了简便方法.然而在生命科学领域,无催化剂反应显然更有利于生理环境下的分子合成,这也体现了点击化学背后受应用驱动的发展逻辑.当然,不同应用场景也为点击反应提出了新要求.本文强调了生物相容性、可扩展性以及智能化会是点击化学未来发展面临的主要挑战,需要深入研究点击化学在复杂应用场景中的反应机制,引入计算机技术帮助提高可扩展性,以及开发光、磁等物理因素控制的反应类型.相信通过新理论、新技术的引入,点击化学领域将会取得更大的突破.

UDP-糖生物合成的研究进展

尿苷二磷酸(UDP)-糖是糖基化修饰利用的一类重要糖供体,从合酶途径、磷酸化酶途径和激酶途径总结UDP-糖的体内合成过程,由于关键酶的缺乏,只有UDP-葡萄糖(UDP-Glc)能从以上3种途径快速合成。通过特定功能酶能够实现UDP-糖之间快速转化,这种转化以UDP-葡萄糖为起始物,以UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)为中间体,在此基础上,概述特定功能酶催化UDP-糖合成的最新进展,探讨脱氢酶、脱羧酶、异构酶和还原酶在UDP-糖转化中的重要作用。最后,剖析UDP-糖合成的现存问题,展望UDP-糖合成的未来研究方向,旨在为更快地挖掘UDP-糖基供体的作用潜能和实现更加高效低成本的糖基化修饰提供新思路。

肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC的高效重组表达体系构建及其酶学性质研究

为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein,MBP)与ChonAC的融合表达载体(MBP-ChonAC),并在低温(15℃)条件下实现MBP-ChonAC的可溶活性表达,通过MBPTrap HP可实现一步纯化,使纯度可达95%以上,酶比活力可达94.1IU/mg融合蛋白(即相当于143.8IU/mgChonAC蛋白当量)。对MBP-ChonAC的酶学研究发现,其最佳催化pH值为7.5～8.0,最佳Ca2+浓度为20mmol/L,最适NaCl浓度为50mmol/L,最佳作用温度为20～35℃。MBP-ChonAC具有较好的热稳定性,在30℃时其半衰期可达8.3h。同时对其以硫酸软骨素A为底物的动力学常数测定发现,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常数kcat稍有降低,但是差别不大,表明MBP的融合没有对ChonAC的催化能力造成影响。通过宿主优化、诱导浓度优化及培养基优化进一步提高了MBP-ChonAC的表达量,其摇瓶培养酶活力就可达10800.5IU/L。

MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建

肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。

百菌清污染土壤生物修复研究进展

针对百菌清具有在土壤中药效稳定、不易分解、代谢周期长、长期大量施加导致土壤严重污染等特点和问题,简要介绍了百菌清的毒性作用机制。总结了降解土壤中百菌清的物理法、化学法和生物法的原理及优缺点。重点阐述了生物修复百菌清污染土壤的主要降解菌株及其效果、降解途径以及降解产物及其毒性,分析了土壤性质、微生物种类、温度、土壤含水率等因素对百菌清降解效果的影响。指出今后的研究重点应为降解中间产物的毒性分析及其进一步的降解与转化问题,而复合菌制剂或多酶复合体系可实现百菌清的彻底降解和无害化。

有机相温敏性脂肪酶催化剂的结构和催化特性

采用不同链长PEO嵌段的Pluronic分子P123、P105、F127及F108，将其端羟基氧化为醛基，使其与脂肪酶CALB的氨基反应形成纳米结合物。TEM分析结果显示CALB-Pluronic结合物在甲苯中呈现直径为20～40 nm的纳米颗粒。所形成的CALB-Pluronic结合物在4-甲基-2-戊酮中呈现温度响应性，降低温度可使酶催化剂沉淀出来，结合物中的Pluronic高分子PEO嵌段越长，其最低临界共溶温度（LCST）越高。采用甲苯为溶剂、正丁醇及正己酸为底物，37℃下的催化实验结果显示 CALB-Pluronic 纳米结合物比天然 CALB 的表观活性提高4～6倍，而反应结束后可通过降温回收酶催化剂，显示出脂肪酶-Pluronic纳米结合物在有机相酶催化中的良好应用前景。

微生物细胞工厂合成五环三萜皂苷类化合物

五环三萜皂苷类化合物具有丰富的药理、生理活性,广泛应用于医药、功能食品、保健品、化妆品等领域。目前五环三萜皂苷类化合物的主要获取方式是植物提取,随着合成生物学的发展,利用微生物细胞工厂合成植物天然产物逐渐成为研究热点,它具有生产周期短、工艺简单、环境友好、条件温和等优势,是未来的发展方向。本文结合五环三萜皂苷类化合物的来源及其天然合成途径,综述了典型五环三萜皂苷类化合物的分类、功能活性、结构特点及目前利用微生物细胞工厂合成五环三萜皂苷类化合物的研究现状;分析了部分五环三萜皂苷类化合物合成途径当中的未解析的关键修饰位点及关键酶,并结合已报道的体内、体外研究,对部分未知途径当中催化母核形成苷元的P450酶以及对苷元进行糖基化修饰的糖基转移酶进行了合理预测;结合当前研究现状分析、总结、归纳了利用微生物细胞工厂合成五环三萜皂苷类化合物存在的主要瓶颈,讨论了现阶段工业化生产现状及利用生物合成进行工业化生产所面临的挑战,为高效合成五环三萜皂苷类天然产物的微生物细胞工厂构建提供了理论支持和新思路。

智能抗逆微生物细胞工厂与绿色生物制造

绿色生物制造作为新的工业模式,在其发酵过程中,生物转化效率往往被环境变化或代谢失衡引起的一系列逆境胁迫所限制,导致细胞工厂生长缓慢、产量下降、生产能耗大幅升高等,严重制约着产业的发展。构建在多重胁迫因子条件下具有良好表现的智能抗逆微生物细胞工厂,为绿色生物制造迎来了新的机遇。本文介绍了绿色生物制造过程中微生物细胞工厂面临的胁迫因子及其胁迫机理,综述了提高微生物细胞工厂耐受性的主要策略,包括非理性技术增强细胞自身防御系统及以工程化思维、借助合成生物学技术有针对性地设计并集成抗逆基因线路,重编程微生物细胞工厂提高其抗逆能力,最后对智能抗逆微生物细胞工厂在生物医药、大宗化学品、食品等绿色生物制造涉及领域的应用进行展望。期待本文为实现细胞工厂对环境胁迫的应答与智能调节提供新的研究思路。

临床肝素类药物酶解分析二糖组成

肝素是一类结构复杂的高分子糖类,以N-硫酸、6-O硫酸氨基葡萄糖和2-O硫酸艾杜糖醛酸为主要成分组成二糖。常见的肝素注射液是以未分级肝素为原料纯化灭菌制备而来,在临床上使用更为广泛的是将肝素降解得到的低分子片段,低分子肝素保留了肝素糖链基本结构,但是不同制备工艺导致其具有不同的还原及非还原端。本研究以肝素类药物为研究对象,使用肝素裂解酶Ⅰ,Ⅱ及Ⅲ将肝素注射液、低分子肝素注射液(达肝素、那屈肝素、依诺肝素)、化学合成的类肝素(磺达肝素)进行酶催化降解产生二糖,结合强阴离子交换色谱(Strong anion exchange high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)以及紫外检测器在线分析,使用市售肝素二糖标准品确定各种二糖结构。此外,使用反向离子对色谱和电喷雾质谱联用分析磺达肝素中的甲基二糖以及达肝素和那屈肝素中的脱氨二糖结构,为肝素以及类肝素药物的质量控制提供更为精确的结构信息。

紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素的基因毒性评价

目的:考察紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素以及二者混合物的基因毒性,为其更广泛的活性研究和应用奠定基础。方法:利用SOS/umu检测试剂盒定量分析紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素、二者混合物以及各自的S9代谢产物是否刺激鼠伤寒沙门菌Salmonella typhimurium NM2009细胞产生了SOS修复,以及与阳性药物2-氨基芴(2-aminofluorene,AF-2)和2-氨基蒽(2-aminoanthracene,2-AA)进行对比所产生毒性作用的强弱。结果:32.6 μg/m L的脱氧紫色杆菌素、经S9代谢后的34.2 μg/m L的紫色杆菌素和33.4 μg/m L的混合物对S.typhimurium NM2009细胞产生了基因毒性,但与阳性对照物相比属于低毒性物质,且相同剂量的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素以及二者混合物的基因毒性基本相同,二者混合后未产生协同效应。结论:紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素属于低基因毒性物质。

脱氧紫色杆菌素抑制结肠癌TH29细胞增殖及诱导凋亡作用与机制

目的探讨脱氧紫色杆菌素(Deoxyviolacein)对人结肠癌HT29细胞增殖抑制和诱导凋亡及其可能机制。方法用不同浓度的脱氧紫色杆菌素处理HT29细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,检测脱氧紫色杆菌素对HT29细胞的抑制率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western Blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase9表达的变化。结果脱氧紫色杆菌素对HT29细胞有明显的增殖抑制作用;可提高G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例;细胞凋亡率升高,Bax和Caspase9蛋白表达升高,Bcl-2蛋白的表达降低。结论脱氧紫色杆菌素抑制结肠癌HT29细胞增殖并诱导凋亡,其凋亡机制可能作用于线粒体介导的内源性通路。

异源CYP450酶的表达优化促进工程酿酒酵母合成熊果酸

熊果酸(UA)是具有多种生理及药理活性的植物来源五环三萜类羧酸,尽管在酿酒酵母中已经实现了UA的从头合成,但仍存在产量低、副产物积累、营养供给冗余等问题,无法实现工业化生产。为了提高酿酒酵母合成熊果酸的能力,通过多种方法优化了UA合成途径中异源CYP450酶的表达。探究了位置效应对CYP450基因表达的影响,初步筛选到CYP450的基因组最佳整合位点(HO位点),通过单独增加CYP450的拷贝数或同时增加CYP450及CPR的拷贝数,确定了同时存在3个CYP450和CPR拷贝时CYP450酶具有最佳催化活性,进行培养基优化后UA摇瓶产量达到(266.54±6.50)mg/L,最终在5 L发酵罐进行放大培养UA产量达到(2825.58±36.26)mg/L。本研究可为在酿酒酵母中通过表达优化策略调控其他三萜类化合物的合成提供参考。

高分子修饰/无机晶体固定化酶研究进展

具有良好化学、区位和立体选择性的酶是化学品绿色合成的理想催化剂。然而,由于天然酶存在易失活、重复使用困难等问题,以致酶催化的应用范围受到较大限制。随着生物技术、材料科学和纳米技术的快速发展,开发简单、低成本、适用性广的酶固定化载体和方法,提高酶催化剂在工业催化中的应用性能得到了研究者的广泛关注。本文中,笔者总结了近年来在利用功能高分子修饰酶、共沉淀法制备酶-无机晶体复合物方面的一些工作,探讨了这些新型修饰酶和固定化酶的性能、优缺点、应用前景以及未来发展。

甲醇的生物利用与转化

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料。利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成。基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴。

基于刺激响应性高分子的智能酶催化剂研究进展

将刺激响应性高分子和生物酶分子相结合可设计、构建智能酶催化剂,该类智能酶催化剂同时具备了材料对环境的响应性能和酶的催化性能,可很好应用于可控生物催化、药物递送、分析检测、智能设备开发等新兴领域,极大地扩展了酶催化的应用范围,是智能生物材料研究的热点方向。本文按刺激响应类型总结了过去二十年间智能酶催化剂的研究进展,分析了智能酶催化剂的构建方式和性能特点,并举例介绍了其可能的应用领域。

rCAA处理高无机灰分工业废水的污泥减量化效果

研究了好氧/厌氧反复耦合固定生物反应器(r CAA)处理高无机灰分工业废水的污泥减量化效果。结果表明,反应器中SS和COD存在线性关系,SS的堆积提高了污泥的产率系数,采用周期性清理r CAA反应器底部淤泥的方式进行处理,能有效降低反应器的污泥产率,同时提高和稳定出水水质;各厌氧仓的污泥溶解作用以及好氧仓内异养菌和自养硝化菌对基质和DO的竞争关系直接影响反应器的出水氨氮浓度。