P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建

目的：如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能？实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型。方法：实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成。①材料：P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供。钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成。②实验方法：P19细胞按1×10^7L^-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d。③实验评估：观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白TroponinT的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiacactin、gata-4的表达。结果：①P19细胞经1,5,10nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞。P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc及10mg/LN-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%。②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白TroponinT呈阳性表达。③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacactin、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5mg/LN-cad-Fc。④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现,RT-PCR检测无心肌标志性基因表达。结论：①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白TroponinT的表达早于心肌跳动的出现。②作为一种基质模型来模拟细胞间黏附,2.5mg/LN-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件。③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用。

N-钙黏素融合蛋白抑制P19分化伴随的细胞凋亡

目的:讨论N-钙黏素融合蛋白N-cad-Fc对P19细胞分化过程中伴随的细胞凋亡的影响。方法:分子生物学技术制作N-钙黏素融合蛋白N-cad-Fc。视黄酸(retinoic acid,RA)诱导P19细胞分化,培养于明胶(gelatin)包被培养板上的P19细胞为对照组,普通光学显微镜观察其神经分化情况,TURNEL法和DNA片段化分析法检测细胞凋亡情况,alamarBlueTM染色法检测细胞存活情况。结果:培养于N-cad-Fc包被培养板上的P19细胞经RA诱导分化后细胞形态与明胶包被培养板上P19细胞分化形态一致,但分化过程中伴随的凋亡现象被明显抑制,分化诱导后细胞的存活率大大提高。结论:使用N-cad-Fc融合蛋白培养技术可以在不影响细胞分化状态的前提下降低分化过程中细胞的死亡率,为开发低死亡率的高效细胞分化诱导方法创造了条件。